Presentation - M2-Chimie-Univac - 2022-2023

Université Félix Houphouët Boigny Ecole Normale Suprérieure
UNIVAC 2023
Master II
METHODES
DE
CARCTERISATION & SEPARATION
DE
COMPOSES ORGANIQUES
Prof. ATTIOUA
ECUE-1
METHODES DE
CARACTERISATION DES
COMPOSES ORGANIQUES
GRANDES FAMILLES
DE
COMPOSES ORGANIQUES NATURELS

• INTRODUCTION
• La nature est la plus grande source de médicaments pour
l’Homme.
• Depuis des millénaires, les plantes sont employées par
l’homme pour ses besoins (santé, nourritures, habitat, etc.
• Les recueils de plantes actives constituent souvent les

premiers écrits parvenus des civilisations anciennes :
– les papyrus d’Ebers en Égypte
– les papyrus du Charaka Samphita en Inde
• La synthèse des métabolites par la plante est un processus

long s’étalant sur des milliers d’années
• La science, à travers la biogénèse, permet d’expliquer cela
INTRODUCTION
• On distingue 3 règnes de molécules naturelles:
• Règne minéral : constitué d’éléments minéraux (Na ,
K, Mg, Ca, Fe, Zn, Se, Mn, I, Co , Cr, Si, Sn, etc.)
• Il représente une petite partie de la pharmacopée
• Règne animal: utilisation d’organes ou produits

animaux (testicules, pancréas, foi, sang, venin, etc.)
•
• Règne végétal : constitué d’organes, dérivés de
plantes (feuilles, écorces, fleurs, fruits, etc.),
• C’est la plus grande source de molécules naturelles.
•FAMILLE DES LIPIDES
• Composés naturels abondamment présents dans le
règne animal et le règne végétal.
• Une classe très hétérogène car très peu de rapport

entre les différents sous groupes
• Composés naturels abondamment présents dans le
règne animal et le règne végétal.
• Une classe très hétérogène car très peu de rapport

entre les différents sous groupes
• FAMILLE DES LIPIDES
• Les acides gras
• Composés à longue chaîne carbonée, saturée ou
insaturée, possédant un nombre paires de carbones
• Exemples :
Acide palmitique : CH3-(CH2)14-COOH

Acide stéarique : CH3-(CH2)16-COOH
Acide arachidique : CH3-(CH2)18-COOH
Acide oléique : CH3-(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-COOH
Acide linoléique : CH3-CH2-(CH=CH-CH2)3-(CH2)6-COOH
FAMILLE DES LIPIDES
• Les glycérides
• Corps gras d’origines animale ou végétale
• Ce sont des triesters du glycérol et d’acide gras
CH2 OH O
O R
O CH2 O C
HO + R C
R C O
Glycerol OH O
CH2 OH Acide gras R
Triglycéride CH2 O C
FAMILLE DES LIPIDES
• Quelques denrées riches en les glycérides
Arachides
Karité
Coco
• FAMILLE DES LIPIDES
• Les cires
• Esters d’acides gras et de monoalcools,
• Elles comportent 16 à 36 atomes de carbone.
• La partie acide porte parfois des groupes hydroxyles
• Exemple : la cire d’abeille
O
C
CH3 (CH2)n O (CH2)m CH3
• avec n=24,26 et m= 29,31

• FAMILLE DES TERPENES
• Très répandus dans la nature.
• Dans les plantes (feuilles, tiges, racines, écorces,
fleures, fruits…).
• Elles ont une structure de base formée par 5
atomes de carbone: isoprène
5
CH3
3 4
2
C C CH2
H ou
1
CH2
isoprene C5H8
FAMILLE DES TERPENES
n=1 C5H8 Hémiterpènes

n=2 C10H16 Monoterpènes
n=3 C15H24 Sesquiterpènes
n=4 C20H32 Diterpènes
n=5 C25H40 Sesterpènes
n=6 C30H48 Triterpènes
n=8 C40H64 Tétraterpènes
• Pas de n=7
• Monoterpène C10 ou 2C5
• Ce sont les constituants odorants des essences
végétales.
• Limonène : constituant de l’essence de menthe et
de citron
• Le pinène constitue 20% de résine de pin
CH2OH
OH OH
geraniol menthol limonène (-)menthol -pinène Campjre

Sesquiterpène C15 ou 3C5
Diterpènes C20 ou 4C5
OH
farnésol OH
Vitamine A
Sesterpène C25 Triterpène C30

H3C CH3
CH3
CH3
CH3
CH3 CH3 H
O
acide gascavelique H CH3

H3C CH3 HO -amyrine
H 3C CH3
COOH
Tétraterpène C40
-carotène
• FAMILLE DES STEROÏDES
• Toutes les stéroïdes possèdent le cycle
Cyclopentanoperhydrophenanthrène
• Exemples: acide biliaire, stérols, hormones

sexuelles, cardiaque glycosides etc.
• Les stéroïdes sont largement distribués dans la

nature.
• On les trouve aussi bien à l’état libre comme sous

forme combinées tels que les ester ou glycosides.
• Très souvent, ils se trouvent sous la forme d’un

mélange complexe.
• Les stérols
• Le cholestérol est le stérol le plus abondant dans la
nature.
• On le retrouve dans les plantes, les algues, les
vertébrés et invertébrés.
21
22 21
H3C 22
20 26 H3C
20 26
18 CH3 CH3
18
CH3 CH3
17 25 17 25
11 11
19 13 16 19 13 16
CH3 CH3 CH3
CH3 28
1 27 1 27
14 14
CH3
10 8 10 8 29
Cholestérol Stigmastérol
5 3 5
3
HO HO 6
6
• FAMILLES DES STEROÏDES
• Les cardiaques glycosides
• Stéroïdes ayant un effet spécifique et puissant sur
les muscles cardiaques.
• On les utilise comme poisons.
• On les rencontre dans les plantes
Fumaria officinalis Alstonia bonei

• On distingue 2 grands groupes :
• Cardénolide : ce sont des stéroïdes à C23 ayant un

groupe lactone ,-insaturé à cinq côtés, en position
17 et un groupement hydroxyle (OH) en position 14
O
O
CH3
HO
CH3 H
H OH
HO Sarmentogenine
H
• Bufadiènolide : ce sont des stéroïdes à C24 ayant

un groupe lactone doublement insaturé à six côtés
en position 17 et un groupe 14-hydroxyle (OH) ou
ses modifications.
• On les rencontre uniquement dans le règne animal
O
O
O O
CH3 CH3
CH3 CH3
O
OH
HO
Bufalin
HO
Marinobufagine
H
OH
• Les sapogénines
• Ce sont les glycosides des plantes qui ont les
propriétés moussantes en présence de l’eau. Ils
peuvent avoir une partie sucre comme être sans
sucre. CH3 CH3 CH3
O O CH3
H
H
CH3
CH2OH CH3
O
O
CH3 OH
CH3
HO
HO Cholegénine
H
HO Tokorogénine
H
• FAMILLE DES GLUCIDES
• Le nom Hydrates de carbone à cause de leur
formule générique de base Cn(H2O)n,
• Molécules organiques caractérisées par la présence
de chaînons carbonés porteurs de groupements
hydroxyles, et de fonctions aldéhydes ou cétones, et
éventuellement de fonctions carboxyle ou amine.
•
• Les glucides sont formés dans les plantes vertes par
photosynthèse suivant la réaction :
xCO2 + xH2O hv (CH2O)x + O2
• Les glucides divisent en OSES et OSIDES

GLUCIDES
(hydrates de carbone)
OSES OSIDES
(Monosaccharides
sucres simples) hydrolysables
non hydrolysables
HOLOSIDES HETEROSIDES
hydrolyse oses hydrolyse oses + aglycone
OLIGOHOLOSIDES POLYOLOSIDES
(Oligosaccharides) (Polysaccharides)
• Les glucides existent naturellement sous deux

formes
• Forme Linéaire : Projection de FISCHER
CH2OH
CHO CHO O
OH OH HO
HO HO OH
OH HO
OH
OH OH
CH2OH
CH2OH Glucose CH2OH Galactose
fructose (levulose)
• 2. Forme cyclique: Projection de HAWORTH

CH2OH CH2OH
O CH2OH
O OH O
OH OH OH
OH CH2OH
OH OH OH
Glucose OH Galactose OH OH Fructose

• FAMILLES DES ALCALOIDES
• Composés organiques azotés d’origine naturelle.
• Proviennent des végétaux
• Plus ou moins basiques
• Dotés, à faible dose, de propriétés
pharmacologiques marqués.
• Toxiques à fortes doses
• Le nom alcaloïde vient du fait que ce sont des
substances naturelles agissant comme des alcalis
(de l’arabe al kaly = soude et du grec eidos =
aspect)
• FAMILLES DES ALCALOIDES
• Plus de 8 000 composés naturels ont été identifiés
comme alcaloïdes à ce jour.
• Difficile de les présenter sous un seul noyau

• Classifications variées selon l’auteur
• - suivant leurs structures chimiques,

• - suivant l’activité biologique et écologiques
• - suivant leurs voies de biosynthèse.
• Drogues à alcaloïdes
Hyoscyamus niger L.
• Drogues à alcaloïdes
Papaver somniferum L (Opium)

• FAMILLES DES POLYPHENOLS
• Le terme «polyphénols» désigner l’ensemble des

composés phénoliques des végétaux.
• Composés très diversifiés,

• Ils sont caractérisé par la présence d’un ou plusieurs
cycles benzéniques (C6) portant un ou plusieurs
fonctions hydroxyles (OH).
FAMILLES DES POLYPHENOLS
Principales classes de composés phénoliques
Squelette carboné Classe Exemple
C6 Phénols simples Catéchol
C6-C1 Acides hydroxybenzoïques p-hydroxybenzoïque
C6-C3 Acides hydroxycinnamiques Acides caféique
C6-C4 Naphtoquinones Juglone
C6-C2-C6 Stilibènes Resvératrol
C6-C3-C6 Flavonoïdes Quercétine
(C6-C3)2 Lignanes Pinorésinol
(C6-C3)n Lignines
(C15)n Tannins
Les formes simples des phénols

• Structures chimiques allant de C6 à C15
R1
OH
R2 COOH
COOH
R3 CHO
Phénol
O COCH3 R4
C6: phénol Acide acétylsalicylique
OCH3
OH
Vaniline
C6-C1 : Acides hydroxybenzoïques

C6-C3 : Acides hydroxycinnamiques
COOH
COOH COOH
R1
HO H
R2 HO
HO
R3 H
H
Acide acaféique Acide p-coumarique
C6-C2-C6 : Stilibènes C6-C4 : Naphtoquinones

HO
O
OH
HO
Resvératrol Juglone
OH O
Rosmarinus officinalis L.
• Origines
Cynara scolymus L.
Ac. rosmarinique
Cynarine
• Les flavonoïdes
• Molécules aromatiques polysubstituées
• Rôle de métabolites secondaires chez les plantes.
• Une l’une des plus abondantes classes dans la nature
• Plus de 9000 structures naturelles ont été isolées et
caractérisées.
• Puissants anti-oxydants
• Leurs structures s’organise autour d’un squelette
• 1,3-diphénylpropane C6-C3-C6,
• Structure des flavonoïdes
C6 C3 C6
5'
6' 4'
Squelette 1
B
8
1,3-diphénylpropane O
9 2
1' 3'
7
A 2'
C
3
6
10
5 4
Structure tricyclique communeaux flavonoïdes
• Le chaînon propyle C3 peut être complété par une
fonction éther formant ainsi un cycle central, appelé
cycle C.
• Les flavonoïdes se divisent en plusieurs sous-classes

qui se distinguent par une diversité fonctionnelle au
niveau des positions 2, 3 et 4 du cycle C
• Au sein d’une même sous-classe, les possibilités de

substitution des cycles A et B sont multiples.
• Onze carbones du squelette flavonoïde peuvent
porter un substituant de type:
• hydroxyle OH,
• méthoxyle O-CH3,
• méthyle -CH3,
• isoprényle -CH(CH3)2
• benzyle. C6H5-
• Origines
Chardon-marie
• Biogénèse
• Les flavonoïdes résultent de la cyclisation du
chalcone
Les 12 sous classes des flavonoïdes
HO OH
HO O
HO O
CHALCONE FLAVONE
OH O OH O
OH O
FLAVANONE
HO O
HO O HO O
OH
FLAVONOL
OH O
OH
FLAVANE FLAVANONOL
OH O
OH
Les 12 sous classes des flavonoïdes (suite)
HO O
HO O
OH
FLAVAN-3-OL
FLAVON-4-OL Cathéchine
OH
OH HO HO O
OH
HO O
FLAVAN-3,4-DIOL
OH OH
OH
HO O ANTHOCYANIDINE
OH HO O
ISOFLAVONE
AURONE
OH O
OH O
• NB:
• Les innombrables colorations des fleures, feuilles,
fruits ou écorce des plantes est due aux
anthocyanines.
• La structure commune aux anthocyanines est l’ion

flavylium.
O
• Ce sous groupe des flavonoïdes peut être subdivisé
en trois sous-sous groupes : OH
HO O
HO O
OH
OH
OH
OH OH
OH
OH Pelargonidine OH
Delphinidine
HO O
OH
OH
OH
Cyanidine
• Les leucoanthocyanidines
• Ce sont des flavan-3,4-diols.
• Ces composés non colorés donnent une coloration
rouge avec les acides.
• Ce sont des composés très répandus dans les plantes.
OH
HO O 2 Leucopelargonidine
OH
CH3 HO O
3 OH
4
OH
HO CH3 CH3
OH
Melacidine OH
HO CH3
OH
• Le noyau flavylium peut se protonner facilement

• Un changement de couleur selon le pH
phenate
• Drogue à anthocyane
Vitis vinifera L.
• Les tannins
• Substances naturelles phénoliques
• Précipitent les protéines à partir de leurs solutions
aqueuses.
• Présentes dans toutes les parties des végétaux

• (écorces, racines, feuilles, fruits, etc.) où
• Ils jouent dans la plante le rôle d'armes chimiques

défensives contre certains parasites.
• Les tannins
• On distingue:
• - les tannins hydrolysables (gallotanins et
ellagitanins)
• Ils sont abondants chez les dicotylédones et certains
arbres en fabrique en grande quantité.
• Ils se caractérisent par le fait qu’ils peuvent être
dégradés par hydrolyse chimique (alcaline ou acide)
ou enzymatique.
• Exemple de tannin hydrolysable

HO OH
OH
HO
O
O
O OH
HO
O
O OH
O
O
HO
O O
O O OH
OH OH
HO
OH
HO OH
pentagalloylglucose.
Drogues à tanins hydrolysables
• Les tannins condensés: des oligomères ou des
polymères de flavane-3-ols (eventuellement de
flavane-3,4-diols) dérivés de la (+)-catéchine ou de
ses nombreux isomères.
• Ils sont résistant à l’hydrolyse et seules des
attaques chimiques fortes permettent de les
dégrader.
• Ainsi, par traitement chimique à chaud, ils se
transforment en pigments rouges.
• Les tanins condensés sont très abondants dans

certains organes végétaux (pomme, prune, fraise
etc.) ou des boissons fermentées ou non (thé, vin,
cidre etc.). HO HO HO
R
R R HO
HO
HO
OH OH
OH O
O
O
OH OH
OH HO HO
HO n
Drogues à tanins condensés
Vitis vinifera L.
• FAMILLES DES QUINONES
• Un vaste groupe de composés naturels (pigments)
qu’on rencontre très souvent dans les plantes.
• Certains ont été isolés dans les microorganismes,
dans les animaux marins et dans certains insectes.
• Généralement les quinones sont de coloration
jaune, rouge ou brune.
• Sous forme de sel d’hydroxyquinones, ils prennent la

coloration bleue, verte pourpre.
• Propriétés physiologiques
• - antibiotique
• - anti oxydant
• Benzoquinones
• Structures de quelques dérivés benzoquinones
O O O
CH3 CH3O CH3
CH3O CH3
p-Benzoquinone Aurantiogliocladin
O 2-Methylbenzoquinone
O O
• Naphtoquinones
• La plupart sont isolées des plantes
O
O
O
O H3C
CH3
O CH3
CH3
Chimaphilin O O CH3
O
Naphtoquinone Duninnione
OH
Phthiocol
O
• Anthraquinones
• Ce groupe est le plus étendu
• La plupart de ces pigments sont fournis par les
familles de plantes suivantes:
• - Rubiacée,
• - Polygonacée,
• - Rhamnacée et Légumineuse
O OH O OH
CH3
8 1
7 2
6
3
5 4
HO CH3
Tectoquinone
O
Emodine O
• FAMILLES DES COUMARINES
• La famille des coumarines est formée de
composés phénoliques dérivés de la coumarine
simple, la 2H-1-benzopyrane-2-one, molécule
elle-même dénuée de groupe hydroxyle
phénolique OH.
4 5
3 6
2 7
1 8
O O
2H-1-benzopyrane-2-one ou coumarine
• Toutes les coumarines sont substituées en C-7

par un hydroxyle phénolique.
• FAMILLES DES COUMARINES
• Les divers groupes hydroxyles en C-6, C-7 et C-8,

peuvent ensuite être méthylés.
• Structure des coumarines
R1 CH3
CH3
O C
CH3
C CH
O
CH2
O O O O O O
R2 7,6-Furanocoumarines C Rutacultin
O CH3
FAMILLES DES COUMARINES
Origines
Marronnier d’inde
ANALYSES QUALITATIVES
DES
COMPOSES ORGANIQUES
INTRODUCTION
• La quantité et la qualité des métabolites
secondaires synthétisés varient
• - selon l’espèce végétale
• - selon la climat,
• - selon la région
• - le sol
• Différentes méthodes permettent de les évaluer de
façon rapide et précise.
• Certaines sont basées sur des réactions chimiques
• D’autres font appel à des techniques de pointe.
INTRODUCTION
• Les observations nécessitent parfois des
révélateurs:
• - Révélation en UV : Si la plaque est

fluorescente, sous une lampe UV, toute la
plaque apparaît verte sauf là où sont les
taches.
• Les dérivés aromatiques absorbent dans l'UV.
INTRODUCTION
• - Révélation à l'iode: les composés organiques forment
des taches jaune-marron en présence d'iode.
• Dans un flacon, placer la plaque et quelques cristaux
d'iodes, puis boucher. Les taches apparaissent.
• - Révélation par atomisation: Cette technique utilise un

atomiseur contenant le révélateur en solution. Selon le
produit à révéler, la solution peut-être :
• - Ninhydrine pour les acides -aminés (taches violettes qui
brunissent pour disparaître en quelques jours)
• - Acide sulfurique à 50% pour à peu près tous les composés (taches
noires).
INTRODUCTION
• Pulvérisation : On pulvérise le révélateur sur la
plaque,
• NB
• se placer à 20 cm de la plaque et éviter toute
formation de gouttelettes.
• Le révélateur doit-être appliqué en plusieurs
pulvérisations.
• CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE
• La chromatographie sur couche mince (CCM)
• En angalis Thin layer chromatography (TLC)
• une technique d’analyse qualitative et de
purification.
• La CCM analytique permet d’identifier un

composé, de vérifier sa pureté, de suivre
l’avancement d’une réaction ou de choisir le
meilleur système d’élution pour une
chromatographie sur colonne.
• La CCM préparative permet de séparer ou purifier un

produit.
• NB
• Une plaque de CCM est un support en verre, en
aluminium ou en plastique sur lequel a été étalée
une phase stationnaire en couche uniforme.
• On ajoute souvent un pigment fluorescent pour

permettre une détection des produits à la lumière
ultraviolette à 254 nm ou 366 nm.
• Révélation par pulvérisation
• Rapport frontale
• Une substance peut être caractérisée par son Rf.
• Cette valeur permet d’estimer sa polarité.
• Dans un solvant d’élution donnée, plus le Rf est
grand, plus la polarité du composé est faible.
• Le Rf est toujours compris ente 0 et 1.
distance de migration de la substance

Rf =
distance de migration du front de solvant
• Le rôle principal de la CCM est analytique

ANALYSES QUALITATIVES PAR CCM
• Identification des dérivés stéroïdiques
• Phytomolécules ayant le noyau

Cyclopentanoperhydrophenanthrène dans leur structure
17 17
11 11
1 1
10 10 14
14
3 3
5 5
• Identification des stérols et diterpènes
 Solution de chlorure d’antimoine III [27]
• OBV: Les diterpènes apparaissent sous forme jaune-rouge
à bleu-violet.
• Observer aussi en UV 365 nm
Attention!! Les diterpènes réagissent aussi à ce test

• Identification des stérols
 Test au chlorure de bismuth (III) [325]
• OBV: On chauffe la plaque à 110 °C jusqu’à
fluorescence optimale des taches sous UV à ondes
longues (365 nm)
• ANALYSES QUALITATIVES PAR CCM
• Identification des sapogénines stéréoïdiques et des stérols

[330] CH3
CH3
 Test au chlorure de zinc

O
CH3 CH3
HO
Diogénine
OBV: fluorescences Sous UV à ondes longues
• Identification des cardiaques glycosides
O
O
CH3 H
 Réaction de KEDDE [99] CH3
OH
HO
Digitoxigénine
H
• OBV: Les cardiaques glycosides sont colorées en bleu-violet
Dans le visible
Dans UV 365 nm
• Identification des cardiaques glycosides
 Test au chlorure d’Antimoine (III) SbCl3
• OBV : Observation dans Vis et à UV-365 nm.
• Les Cardiaques glucosides et saponines sont détectés
• Identification des alcaloïdes
 Test de Dragendorff selon Munier [120]
• Il est préparé à partir de Nitrate de bismuth basique,
acide tartrique (HOOC-CHOH-CHOH-COOH) et KI.
 Test de Dragendorff selon Macheboeuf [121]

• Préparé à partir de Nitrate de bismuth basique,
Acide acétique cristallisable, KI.
• NB!!: Alcaloïdes et les composés azotés réagissent

positivement à ces tests; il faut un test de confirmation
• Identification des alcaloïdes
• OBSV : Après vaporisation de ce réactif, la formation
instantanément d’une tâche jaune-orangée indique la
présence des alcaloïdes et des composés azotés
• Test des formes simples des phénols
 Réactif de Gibbs : MeOH. [78]
• Mode opératoire
• Vaporiser une solution fraichement préparée de
dibromo -2,6 quinonechlorimide à 0,5% dans le
méthanol.
• Vaporiser ensuite le carbonate de sodium à 10%
dans l’eau ou bien placer dans une cuve contenant
une solution d’ammoniaque (25%).
• OBV: On observe des taches caractéristiques des

phénols
• Identification des flavonoïdes
Chlorure d’aluminium (à 1% dans l’éthanol)[4]
OBV: En UV à ondes longues (366 nm)

apparition de fluorescence jaune dans les
zones correspondant aux flavonoïdes.
 Chlorure de fer (FeCl3) (1 à 5% dans HCl 0,5M)
• OBSV : en UV 366 nm
• Les acides hydroxamiques se colorent en rouge,
•
• Les phénols en bleu ou virent sur le vert
 NEU ou NP/PEG : Natural Products/PolyEthylenGlycol
• OBV: fluorescences intenses observées immédiatement ou
après 15 min sous UV-365 nm.
NE/PEG, UV-365 nm
• Caractérisation des coumarines et quinones
 Solution de KOH à 10% dans éthanol
• OBV: Dans le visible ou sous UV-365 nm, sans chauffage
préalable.
•anthraquinones (rouge),
•anthrones (jaune, UV-365 nm),
•coumarines (bleue, UV-365 nm).
Révélation sous UV-365 nm
des coumarines, sans
traitement préalable de la
plaque
Révélation sous UV-365 nm

des coumarines, après
traitement de la plaque avec
du KOH 10%
• ANALYSES QUALITATIVES PAR REACTION EN TUBE
• Ces tests se font dans des tubes à essai et les

observations sont basées:
• - sur les précipitations
• -sur les changements de coloration de la solution

• Caractérisation des stérols et terpènes

Test de Lieberman et Bürchard
• Laisser macérer 1g de broyat dans 20mL d’hexane
pendant 24h
• Filtrer et complété à 20mL.
• Dans une capsule, 10mL de cet extrait sont
évaporés à sec et repris avec 1mL d’anhydride
acétique puis 1mL de chloroforme.
• Un volume de 1 à 2mL d’acide sulfurique est
déposé au font du tube contenant l’extrait.
• Caractérisation des stérols et terpènes
Test de Lieberman et Bürchard
• OBSV : En cas de réaction positive, il se forme un
anneau rouge-brunâtre ou violet à la zone de
contact des deux liquides, la couche surnageant
étant verte ou violette.
• Caractérisation des alcaloïdes

Test de Dragendorff et Mayer
• 10g de poudre végétale sont ajoutées à 50 mL
d’acide sulfurique (H2SO4) diluée au 1/10.
• Le mélange est agité et macéré pendant 24h à la
température ambiante du laboratoire puis filtré
sur papier.
• Dans 2 tubes à essais contenant chacun 1mL de
filtrat,
• - Test de Dragendorff et Mayer
• Ajouter :
• 5 gouttes de réactifs de Mayer dans N°1
• 5 goutes de Dragendorff dans N°2
• OBSV : La présence d’alcaloïdes est révélée par
l’apparition de précipités dans les 2 tubes.
Test de Dragendorff et Bouchardat
• 6mL d’extrait évaporé sont repris dans 6mL d’alcool à 60°
(degré alcoolique)
• La solution alcoolique est repartie dans 2 tubes à essais.
• - Dans tube N°1, ajouter 2 gouttes de réactifs de
Dragendorff.
OBV: un précipité ou une coloration

orange indique la présence d’alcaloïdes.
Test de Dragendorff et Bouchardat
• - Dans tube N°2, ajouter 2 gouttes de réactif de

Bouchardat.
OBV: une coloration brune-rougeâtre

indique la présence d’alcaloïdes
• Caractérisation des saponosides
Test de mousse
• Introduire 1g de poudre végétale dans un
Erlenmeyer de 250mL.
• Ajouter 100mL d’eau distillée
• Chauffer légèrement le mélange.
• Filtrer, refroidir et compléter à 100 mL avec de
l’eau distillée
• Introduire 20mL du filtrat dans un tube à essais
• Agiter vigoureusement pendant 15 secondes.
• Caractérisation des saponosides
Test de mousse
• Placer le tube verticalement pendant 15 minutes
•
• OBV: Si la mousse persiste, la drogue végétale
contient des saponines.
• Caractérisation des cardiaques glycosides
Test de KELLER KILIANI
• Dissoudre 0.5 g d’extrait dans 2mL d’acide
acétique glacial contenant une goutte de chlorure
ferrique
• Ajouter H2SO4 concentré pour former la phase
inférieure
• OBV: La présence d’un anneau brun à l’interface

indique la présence de désoxy-sucre;
caractéristique des cardénolides
• Caractérisation des cardiaques glycosides
Test de KELLER KILIANI
• OBV: Un anneau violet peut apparaître en dessous
de l’anneau brun, tandis que dans la phase
inférieure un anneau verdâtre peut apparaître
• Caractérisation des flavonoïdes
Test des anthocyanes
• A 5mL d’infusé à 5% dans un tube à essai
• On ajoute 5mL H2SO4 puis 5mL d’hydroxyde
d’ammonium (NH4OH).
• Si la coloration s’accentue par acidification puis
vire au bleu violacé en milieu basique, on peut
conclure la présence d’anthocyane.
OH
OH
HO O
OH
OH
O O
OH
OH
OH
OH
• Caractérisation des flavonoïdes
Test des tanins catéchiques
1mL de solution d’alcool chlorhydrique (mélange de
5mL d’alcool, 5mL d’eau distillée, 5mL d’acide chlorhydrique
concentré) est ajoutée à 5mL d’infusé.
La solution obtenue est ensuite portée à ébullition
pendant 15 minutes
OBV: La formation de précipité rouge soluble dans

l’alcool amylique indique la présence de tanins
catéchiques.
ANALYSES QUALITATIVES PAR REACTION EN TUBE
O
• Caractérisation des quinones

•
Test à la soude (NaOH) O
• 1g de broyat est placée dans un tube avec 15 à 30mL

d’éther de pétrole.
• Agiter et un reposer (24 h),
• Filtrer les extraits et concentrés à l’étuve.
• Ajouter quelques gouttes de soude (1/10) sur les
extraits
• OBV: Si la phase aqueuse vireau jaune, rouge ou

violet, alors présence de quinones libres
. caractérisation des quinones
Test à l’ammoniaque dilué
• On évapore 2mL d’extrait à sec.
• Le résidu est repris avec 5mL de HCl (1/5) puis mis
pendant 30 minutes à ébullition au Bain-Marie
dans un tube à essais.
• Après refroidissement sous courant d’eau froide,

l’hydrolysat est extrait avec 20mL de chloroforme
(CHCl3) dans un tube à essais.
caractérisation des quinones
• - Test à l’ammoniaque dilué
• A la phase organique recueillie, on ajoute 0,5mL
d’ammoniaque dilué 2 fois.
• OBV: Levirage de la coloration au rouge ou violet,

indique la présence de composés quinoniques.
O
• Caractérisation des quinones

Test des anthraquinones O
• - Sur l’extrait chloroformique des broyats, on

ajoute du KOH aqueux 10 % (v/v).
• Après agitation, la présence des anthraquinones

est confirmée par un virage de la phase aqueuse
au rouge.
• ANALYSES DE LA PURETE DES COMPOSES
 Mesure de l’indice de réfraction
• La mesure permet de vérifier de la pureté d’un

composé se présentant sous forme liquide.
• L’indice de réfraction n d’un liquide est défini par

le rapport entre la vitesse de la lumière dans le
vide et dans ce liquide.
Mesure de l’indice de réfraction
• Expérimentalement, cette détermination se fera

par rapport à l’air et non au vide.
• L’indice de réfraction d’un corps pur dépend

•- température de mesure,
•- longueur d’onde de la lumière utilisée,
•- la nature du liquide.
• L’indice de réfraction d’un liquide est
habituellement compris entre 1,3000 et 1,7000.
• La lumière employée est la raie D du sodium.

• L’information est donnée en indice inférieur nD.
• La température de mesurée est indiquée à l’aide

d’un indice supérieur.
• Exemple à 20 °C, on notera nD20.
Mesure de l’indice de réfraction
• L’indice de réfraction diminue si la température
augmentation.
• Si la mesure est réalisée à une température

différente de 20°C, il faut appliquer une
correction afin de comparer cette valeur à celle
théorique.
• On utilise la formule nD20 = nDT- 0,00045(T-20)
• où T est la température en °C.
• NB : Plus l’indice de réfraction mesurée est proche
de l’indice de réfraction tabulé (± 0.001), plus le
composé est considéré pur.
Mesure du point de fusion
• Elle permet de contrôler la pureté d’un composé
solide.
• Principe: la température de fusion est une
grandeur caractéristique d’un corps pur.
• Pour le contrôle, il faut que le corps soit connu.
• En comparant le point de fusion mesuré à celui de

la littérature, on déduit de la pureté de corps.
ANALYSES DE LA PURETE DES COMPOSES
Mesure du point de fusion
• Le corps est considéré comme probablement pur
si la température mesurée correspond à une
différence de ±1°C.
• La mesure est réalisée à l’aide d »un banc de

Kofler.
• BANC DE KOFLER
ANALYSES QUANTITATIVES
DES
COMPOSES ORGANIQUES
• INTRODUCTION
• Quantifier = Doser
• Différentes méthodes de quantification existent
• les quantités des métabolites secondaires

synthétisés varient suivant:
• - le climat,
• - le relief
• - l’espèce végétale
• Les méthodes de quantification sont en partie
basées sur le principe de dosage.
• INTRODUCTION
• Il existe deux grandes catégories de dosage :
 les dosages par étalonnage : méthodes non
destructives basée sur la mesure d’une grandeur
physique de la solution: absorbance, pouvoir rotatoire,
conductance, indice de réfraction...)
le dosage par titrage : méthodes destructives

• Ils font intervenir des réactions chimiques qui
consomment l’espèce à doser.
QUANTIFICATION PAR DOSAGE
Exemple : dosage par spectrophotomètre
• Ce dosage colorimétrique s'appui sur la loi de
Beer-Lambert: A=ϵ.l.C
A : Absorbance de la solution sans unité
ε : Coefficient d'extinction molaire en L×mol-1×cm-1 (aussi noté ξ)
l : Longueur de cuve traversée par la lumière en cm
C : Concentration molaire en mol×L-1
• L’absorbance: donnée spectrophotomètre

qui mesure la densité optique
• L’absorbance augmente avec la coloration
Dosage par spectrophotométrie
Conditions générales de réalisation

• - la substance à analyser doit être colorée
• - la coloration ou l'opacité doit être stable le temps
de faire les mesures,
• - le composé à analyser doit être en très faible
concentration (diluer),
• Conditions générales de réalisation
• - une gamme d'étalonnage doit être réalisée dans
les mêmes conditions physico-chimiques que les
essais,
• - la longueur d'onde du spectrophotomètre doit être
celle qui permet la plus forte absorbance possible.
• Si ces premières conditions sont remplies, un dosage
colorimétrique peut être possible.
Gamme d’étalonnage
• Elle permet de
- Régler le spectrophotomètre
- Déterminer une absorbance à une longueur d'onde
donnée pour: un tube (cuve de spectrophotomètre de
longueur) donnée et pour une concentration en
composé recherché
Il faut donc préparer une faible concentration de

solution de l'élément à doser.
• Gamme d’étalonnage
• Pour la réalisation de la gamme d'étalonnage et du
dosage, le volume final de liquide dans chaque tube
doit être identique.
• On complète avec de l'eau distillée à un même volume

(par exemple 100 ml) en ajustant le niveau à un trait de
jauge
• Gamme d’étalonnage
• NB: Un tube 0 (blanc) doit impérativement être réalisé
pour annuler l'absorbance due aux réactifs eux-mêmes.
Ce tube ne contient pas d'échantillon de composé à doser.
• La gamme d'étalonnage demande beaucoup de précision

et doit être réalisée dans les mêmes conditions que les
essais, par le même opérateur
• La réalisation d'un tableau colorimétrique permet d'éviter

des erreurs lors de la réalisation de protocoles et de noter
les résultats.
• Exemple: Réalisation du tableau colorimétrique d'un dosage

du glucose par le réactif R.
N° de tube 0 1 2 3 4 5 X1 X2
Solution étalon de glucose à 0,01 mol/L en mL 0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 0 0
Prise d’essai en mL 0 0 0 0 0 0 0.5 1.0

Eau distillée en mL 18.0 17.7 17.4 17.1 16.8 16.5 17.5 17.0
R (réactif) en mL 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
Absorbance à 350 nm pour un tube /une cuve 0 0.205 0.494 0.748 1.022 1.280 0.668 1.340
donné(e)
Quantité de glucose en µmol 0 3.0 6.0 9.0 12.0 15.0 7.9 Hors gamme
• Exemple: Réalisation du tableau colorimétrique d'un
dosage
• Après l'obtention des valeurs d'absorbance (A) de la
gamme d'étalonnage :
• - tracer la courbe A= f(m ou C de composé).
• - la droite doit passer par l'origine du repère et
proche de chaque point d'étalonnage
• si la gamme a été bien réalisée (coefficient de
corrélation R2> 99,95 %), soit 0.9995
• Exemple: Réalisation du tableau colorimétrique

d'un dosage
• - reporter à cette droite la valeur d'absorbance
de l'essai pour déterminer la quantité de
composé présent.
• NB: Pour remonter à la concentration en composé à analyser

présent dans le milieu initial, on tient compte du volume de la
prise d'essai et de la dilution éventuelle.
• Exemple: Réalisation du tableau colorimétrique
d'un dosage
Tableau colorimétrique du dosage du glucose par le réactif R.

Dosage des alcaloïdes totaux
• Protocole : Introduire 10g de poudre végétale
dans un Erlenmeyer de 250mL contenant 100 mL
d’acide sulfurique dilué à 10% et 5mL d’eau
distillée.
• Boucher, agiter et laisser macérer à la
température du laboratoire pendant 24 heures.
• Filtrer et compléter à 50ml avec de l’eau distillée.
• Alcaliniser par l’ammoniaque à 50% jusqu’à
atteindre un pH compris entre 8 et 9.
• L’extraction des alcaloïdes est souvent réalisée en
milieu acide.
• Le milieu est acidifié par HCl, H2SO4 ou AcOH
• L’alcalinisation du milieu est faite par

l’hydroxyde d’ammonium (NH4OH) pour libérer
les alcaloïdes.
• Les alcaloïdes sont alors précipités par le réactif

de MAYER ou par celui de DRAGENDORFF
• Protocole
• Ajouter du chloroforme (CHCl3), agiter sans
former d’émulsion et après décantation, retirer la
phase organique.
• Répéter l’opération 3 fois de suite (60mL de

CHCl3 la première, 60mL la deuxième et 30 mL la
troisième fois).
• Protocole :
• Recueillir les phases organiques dans un
Erlenmeyer, sécher sur sulfate de sodium
anhydre et filtrer dans une capsule au préalable
pesée.
• Evaporer à sec au bain marie et repeser la

capsule.
• Protocole
• P1 :masse (g) de la capsule vide,
• P2 : masse (g) de la capsule après évaporation,
• m : masse (g) de la matière végétale initiale
• le pourcentage en alcaloïdes (% Alcaloïdes) est:

Dosage des phénols totaux
• - Test Folin-Ciocalteu
• Il a été décrit dès 1965 par Singleton et Rossi
• Son utilisation est largement répandue
aujourd’hui
• Le test est constitué par le mélange acide

phosphotungstique (H3PW12O40) et acide
phosphomolybdique (H3PMo12O40).
• Test Folin-Ciocalteu
• Principe:
• Le réactif Folin Ciocalteu est réduit lors de
l’oxydation des phénols en un mélange d’oxydes
de tungstène et de molybdène (bleu).
• La coloration (725 nm ≤ Amax ≤ 750 nm) produite est

proportionnelle à la quantité de phénols dans
l’extrait végétal.
• Protocole:
• L’extrait végétal sec est dilué dans de l’eau pour
obtenir une absorbance finale comprise entre 0,5
et 1 nm.
• On réalise une gamme étalon en milieu aqueux
(8 points de concentrations de 0 à 20μg.mL-1)
avec un polyphénol témoin, en général l’acide
gallique ou la quercétine.
I. QUANTIFICATION PAR DOSAGE
• Protocole:
• Le blanc de la réaction ne contenant pas de
polyphénol est réalisé comme le point 0μg/ml de
la gamme.
• Les mélanges réactionnels correspondant à
chaque point de gamme et échantillon sont
agités et incubés 5 min à 40-50°C.
• La lecture de l’absorbance à 760 nm se fait grâce
à un spectrophotomètre.
• - Test Folin-Ciocalteu
• Expression des résultats
• La concentration des polyphénols totaux est
déterminée à partir d’une équation de la régression
linéaire déduite de la courbe d’étalonnage.
• La teneur (T) en polyphénols totaux est exprimée

en mg équivalent d’acide gallique par 100g de matière sèche
• L’expression de T est donnée par la formule:
T : Teneur en polyphénols totaux

C : Concentration de polyphénols en équivalent de l’acide gallique déduite par la courbe
V : Volume de l’extrait total
D : Facteur de dilution
m : masse de la matière sèche
I. QUANTIFICATION PAR DOSAGE
• Exemple de courbe d’étalonnage de l’acide gallique
Dosage des flavonoïdes
• Protocole
• Mélanger 0,5 ml de l’échantillon avec 0,5 ml AlCl3
a 2%.
• Incuber 15 min à température ambiante
• Mesurer l’absorbance de l’échantillon à 510 nm.

• La concentration des flavonoïdes, est déterminée
à partir d’une équation de régression linéaire
déduite de la courbe d’étalonnage.
• La teneur en flavonoïdes est exprimée en mg

équivalent de quercitrine pour 100g de matière sèche
• Cette teneur donnée par la formule suivante :
Y = 5,1403.X
• Cette teneur donnée par la formule suivante :
Y = 5,1403.X
Dosage des saponosides
• Protocole:
• Faire une décoction de 1g de drogue végétale dans 100
ml d’eau distillée.
• Chauffer pendant 15 minutes tout en maintenant une

ébullition modérée.
• Refroidissement , filtrer et ajuster le volume à 100 ml.

• Dans 10 tubes à essais numérotés de 1 à 10,
• Répartir successivement 1, 2, …….10 ml de décocté à

1% préparé,
• Protocole:
• Ajuster le volume dans chaque tube à 10ml avec de
l’eau distillée
• Agiter chaque tube dans le sens de la longueur pendant

15 secondes à raison de 2 agitations par seconde.
• Laisser reposer pendant 15 minutes

• Mesurer la hauteur de la mousse dans chaque tube.
• Protocole:
• Le tube dans lequel la hauteur de la mousse est d’au
moins 1cm permet de calculer l’indice de mousse.
• n = numéro du tube dans lequel la hauteur de la mousse

est proche de 1cm.
• Si la hauteur de la mousse est inférieure à 1cm dans
tous les tubes, l’indice de mousse est inférieur à 100.
• Si la hauteur de la mousse est supérieure à 1cm dans
tous les tubes, l’indice de mousse est supérieur à 100.
ECUE-2
METHODES DE SEPARATION
DES COMPOSES ORGANIQUES
METHODES DE FILTRATION
ET DE
RECRISTALLISATION
• GENERALITES SUR LES SOLVANTS
Les groupes de solvants
• Un solvant est une substance, liquide à sa
température d'utilisation,
• A les propriétés de dissoudre, de diluer ou
d'extraire d’autres substances sans les modifier
chimiquement et sans que lui-même se modifie.
• Utilisés dans diverses secteurs :
• dégraissage,
• peinture,
• synthèse organique etc.
Les groupes de solvants
Formule du Groupe Solvants

composé
R-H Alcanes Hexane, propane, cyclohexane,
Ar-H Aromatiques Toluène, benzène
R-O-R Ethers Diéthyle éther
R-X Alkyl halogéné Dichlorométhane, chloroforme
R-COOR Esters Acétate d’éthyle
R-CO-R Aldéhydes et cétones Acétone, méthyle éthyle cétone
R-NH2 Amines Pryidine, triéthylamine
R-OH Alcool Méthanol, éthanol, isopropanol, butanol
R-CONH2 Amides Diméthylamide
R-COOH Acide carboxylique Acétique acide
H-OH Eau Eau
 Densité et température d’ébullution
Solvants Téb (°C) Densité Avantage Inconvénients

Acétate d’éthyle 77 0.90 Bon pouvoir de Inflammable, difficile à
solubilisation éliminer
Cyclohexane 81 0.78 Peu toxique Facilement inflammable
Dichloro-1,2-éthane 83 1.26 Peu inflammable Légèrement toxique, irritant
Dichlorométhane 40 1.34 Facile à éliminer Forme des émulsions, nocif
Ether éthylique 35 0.71 Facile à éliminer Très inflammable
Hexane 69 0.66 Facile à éliminer Très inflammable
Pentane 36 0.63 Facile à éliminer Très inflammable
Toluène 111 0.87 Peu toxique Inflammable
Trichloroéthylène 87 1.46 Inflammable Légèrement toxique
GENERALITES SUR LES SOLVANTS
 Polarité ou moment dipolaire
• Propriété très importante à savoir lorsqu’on veut
utiliser un solvant
• Le moment dipolaire µ d’une substance peut être
calculé à partir de mesure effectuée sur des solutions
diluées dont ont détermine la constante diélectrique.
• La valeur de µ varie très peu dans une série
homologue.
• Le moment dipolaire global d’une molécule est la

somme vectorielle des moments dipolaires.
Polarité ou moment dipolaire
• Ainsi, un carbone tétraédrique symétriquement
substitué conduit à un moment dipolaire nul.
H Cl
H C H Cl C Cl
µ=0 µ=0
H Cl
H Cl H H
Cl H
C C C C
C C
µ=1,3 Cl µ=1,91 Cl
H µ=0 Cl H Cl
• Trois catégories de solvants suivant la polarité
• Solvant non polaire ou apolaire
• Solvant dont le moment dipolaire est nul ou très
faible
Solvant Polarité (µ) Teb(°C) r (g/ml) Miscibilité
H2O
Pentane 0,0 36 0.626 (-)
Cyclopentane 0,0 40 0.751 (-)
Hexane 0,0 69 0.655 (-)
Cyclohexane 0,0 81 0.7786 (-)
Benzène 0,0 80.0 0.879 (-)
CCl4 0,0 77 (-)
Toluène 0,36 110 0.867 (-)
• Solvant moyennement polaire ou polaire
• Solvant dont le moment dipolaire n’est pas nul
Solvant Polarité (µ) Teb(°C) r (g/ml) Miscibilité H2O
chloroforme 1,2 61 1.48 (-)
Ether 1,3 35 0.713 (-)
Acide formique 1.41 101 1.21 (+)
Ammoniac (liquide) 1,47 (+)
Chlorure méthylène 1,5 40 1.326 (-)
Acétate d’éthyle 77 0.92 (-)
Butan-1-ol 1,63 118 0.803 (-)
Méthanol 1,70 65 0.791 (+)
Acide acétique 1,74 118 1.049 (+)
Ethanol 1,73 79 0.789 (+)
pyridine 2,25 (+)
Acétone 2,8 56 0.786 (+)
Eau 1,85 100 1.00 (+)
• FILTRATION ET ESSORAGE
• La filtration et l’essorage sont des techniques
utilisées en chimie organique pour séparer une
phase solide et une phase liquide.
•
Essorage
• Quand on cherche à récupérer le solide et à se
débarrasser du liquide.
• Pour rendre l’essorage plus efficace, on peut
réaliser un lavage.
FILTRATION ET ESSORAGE
Filtration
• On parle de filtration quand on cherche à
récupérer le liquide et à se débarrasser du solide.
• NB
• Ces deux techniques diffèrent uniquement par la
nature de la phase à isoler
• Ils reposent sur les mêmes principes.
• - la gravité
• - Le vide
• - Filtration par gravité
• Pour pallier ces inconvénients, une filtration sous vide est
souvent utilisée. L’aspiration du liquide est alors assurée
par une trompe à eau ou par une pompe.
• Cette méthode est généralement lente et ne permet pas

une séparation optimale du solide et du liquide.
• - Filtration sous vide
• L’aspiration du liquide est assurée par une
trompe à eau ou par une pompe.
• La filtration sous vide s’effectue souvent à l’aide
d’un entonnoir Büchner sur lequel est disposé un
papier filtre.
• Il s’agit d’un entonnoir en porcelaine ou en
plastique dont le fond est troué à la manière d’un
tamis.
Entonnoir Büchner (sans le filtre). Entonnoir en verre fritté.

• dispositif expérimental
• ELIMINATION DES SOLVANTS VOLATILLES
. Evaporation simple
• Si le solvant est très volatile,
• On l’élimine par évaporation simple.
• On place l’extrait dans un récipient à l'abri de la
lumière
• On laisse s'évaporer le solvant au bout de
quelques heures.
• L'évaporateur rotatif est un appareil utilisé pour
distiller rapidement des solvants dans le but de
concentrer partiellement une solution ou pour
concentrer à sec une solution ou une
suspension.
• Le principe de cet appareil est basé sur la distillation
sous vide (partiel). La solution est chauffée
(généralement 40- 60°C).
• Il est constitué de différentes parties:

• • Un bain d'eau
• • Un ballon (contenant l’extrait)
• • Un réfrigérant qui condense les gaz
• • Un ballon réceptacle (recueillir gaz condensé)
• • Un moteur pour tourner le ballon
• • Un moteur à pompe pour le vide
Système Rotavapor
Pompe
• III.3. La distillation
La distillation simple
• La distillation élémentaire ou simple est utilisée
pour séparer des composés dont les températures
d’ébullition sont très différentes.
• Elle permet, par exemple, de purifier des solvants

volatils contenant des impuretés.
• Le mélange à distiller est placé dans un ballon

appelé bouilleur qui est chauffé à une
température suffisante pour observer l’ébullition.
Le liquide formé (distillat) tombe dans un récipient récupérateur,
Exemple :
Pour récupérer un solvant contenant des impuretés dissoutes, on procède par
distillation r simple : purification des solvants organiques Hexane ; Dichlorométhane,
méthanol, etc.
Distillation fractionnée
• Elle permet, entre autres, de purifier un brut
réactionnel ou de déplacer un équilibre (en
éliminant un produit d’une réaction équilibrée au
fur et à mesure de sa formation).
• C’est une succession de distillations simples dans

une pièce de verrerie appelée colonne à distiller.
• Colonne à distiller ou Colonne de vigeux

• RECRISTALLISATION
• À la suite des étapes de traitement du brut
réactionnel, le produit d’intérêt contient souvent
des impuretés.
• Si c’est un solide, une recristallisation permet
dans la plupart des cas de le purifier
efficacement.
• Cette technique est basée sur la différence de
solubilité à chaud et à froid du produit et des
impuretés dans un solvant ou un mélange de
solvants
RECRISTALLISATION
Principe
• Une recristallisation consiste à solubiliser à chaud
un composé solide impur dans un minimum de
solvant dans lequel le solide pur est insoluble à
froid.
• En refroidissant, le solide recristallise, débarrassé
d’une grande partie des impuretés qui restent en
solution.
• Un essorage permet enfin d’éliminer le solvant et
d’isoler le solide purifié
• RECRISTALLISATION
• Choix du solvant
• Un bon solvant de recristallisation est tel que
- le composé d’intérêt y est Soluble à chaud Insoluble à froid
- les impuretés y sont Solubles à chaud Soluble à froid
• Il est préférable d’utiliser un solvant dont la

température d’ébullition est peu élevée afin de ne
pas détériorer la molécule d’intérêt.
• NB
• - En général, la solubilité augmente avec la température.
• - Plonger le récipient dans un bain de glace pour facilité la
cristallisation
• - Ajouter un peu de solvant dans lequel le produit est insoluble
pour initier la cristallisation
METHODES D’EXTRACTION
AUX
SOLVANTS ORGANIQUES
• GENERALITES
• Une extraction consiste à retirer (extraire) une ou
des espèces chimiques d’un milieu solide ou
liquide.
• En chimie, cela se fait en général à l’aide d’un
solvant.
• L’extraction par solvant consiste à faire passer,
par solubilisation, la substance à extraire dans un
solvant.
• Celui-ci peut être de l’eau, mais généralement il
s’agira d’un solvant organique
• EXTRACTION SOLIDE-LIQUIDE
• On l’appelle encore extraction en continue
• But : extraire les composés contenus dans la
matière organique par un solvant adéquat.
• La matière végétale (Solide) contenant les
substrats à extraire est mise en contact direct
avec le solvant (Liquide) d’extraction.
• Cette extraction peut se faire à froids ou à chaud.
• NB
• Substrat est la substance de base sur laquelle on
effectuera différentes transformations.
• Ici, substance dont on cherchera à extraire les
molécules
• Le but est de dissoudre sélectivement un ou
plusieurs composés contenus dans la matière
organique solide initiale par un solvant adéquat.
• La matière végétale (Solide) contenant les substrats
à extraire est mise en contact direct avec le solvant
(Liquide) d’extraction.
• Cette extraction peut se faire à froids ou à chaud.
EXTRACTION SOLIDE-LIQUIDE
La Macération
• Principe : On laisse séjourner dans un liquide à
froid la matière organique pour en extraire les
constituants solubles.
• Cette méthode est très utilisée en substances
naturelles car, elle permet d’extraire de grandes
quantités de produits.
• Aussi, à froids, de nombreux composés naturels
restent stables longtemps.
• Il y a donc très peu de risque de dénaturation.
• La durée des extractions peut s’étendre sur des
périodes de 12 à 24h.
Macération de matière végétales dans l’eau

L’infusion
• On laisse tremper des végétaux finement
divisés dans de l’eau bouillante de façon à y
dissoudre les principes actifs.
• Exemples : thé, tisanes
La décoction
• On place la matière organique dans de l’eau froide
et on porte le tout à ébullition.
• Exemples : décoction d’écorce de noyer servant à
la teinture, décoction de queues de cerises,…
Le pressage (expression)
• Cette opération consiste à « faire sortir » un
produit en exerçant une pression.
• Les Egyptiens écrasaient des fleurs pour extraire
des arômes ou des parfums ; il en est de même
quand on presse une orange pour extraire le jus.
 L’enfleurage
• Elle consiste à extraire le parfum des fleurs fragiles
grâce à l’absorption effectuée par les corps gras
(graisses animales inodores et pures).
• On étale des pétales de fleurs sur la graisse. Celle-ci
extrait les parfums et les odeurs de la plante et, une
fois saturée, elle est traitée à l’alcool.
 L’enfleurage
• On distingue l’enfleurage à froid (pour les plantes
délicates : jasmin, violette, tubéreuse)
• de l’enfleurage à chaud (la graisse est chauffée entre
60 et 70°C).
L’entraînement à la vapeur d’eau
• Le procédé d’hydrodistillation est la distillation
d’un mélange d’eau et d’un produit naturel.
• Il n'est pas nécessaire de faire un prétraitement
de macération.
• On porte à ébullition le mélange,
• On condense les vapeurs qui se dégagent,
• On récupère les arômes.
• La température d’ébullition du mélange doit être
inférieure à 100°C,
• On récupère ainsi un mélange de substances

organiques et d’eau.
• La température du mélange reste constante
jusqu’à l’épuisement d’un des réactif.
Extraction au Soxhlet
• Nécessite la réalisation d’un grand nombre

d'extractions successives pour obtenir une séparation
satisfaisante
Représentation schématique d'un extracteur de Soxhlet
MONTAGE FONCTIONNEMENT
Composant du l’extracteur Soxhlet
1-Agitateur magnétique
2-Ballon à col rodé
3-Retour de distillation (tube d'adduction)
4-Corps en verre
5-Filtre
6-Haut du siphon
7-Sortie du siphon
8-Adaptateur d'expansion
9-Condensateur
10-Entrée de l'eau de refroidissement
11-Sortie de l'eau de refroidissement
EXTRACTION LIQUIDE-LIQUIDE
• On parle aussi d’extraction en discontinue
• L’extraction liquide-liquide est une méthode de
purification basée sur la différence de solubilité
d’un soluté dans deux phases non miscibles.
• En chimie organique, on utilise habituellement
une phase aqueuse et une phase organique
• Extractions qui se font généralement à froids.
Dispositif d’extraction
Erlenmeyers Eprouvette graduée

Ampoule à décanter
• EXTRACTION LIQUIDE-LIQUIDE
Principe de l’extraction liquide-liquide
• Basé sur la solubilité des solutés dans deux
solvants non miscibles (2 phases)
Formation d’une émulsion
• En cas de formation d’une émulsion, il faut:
• - Patienter ; Ajouter du sel (NaCl) , Filtrer ; Centrifuger; -
Ajouter quelques gouttes de solvant polaire (MeOH,
EtOH, acétone)
Formation d’interface
• Les prélever dans la phase organique (extraction)
• Les éliminer dans la phase aqueuse (lavage)
Exemple d’extraction en continue
Phase aqueuse
Solvant organique
Phase hydroalcoolique
Phase organique
Grandeurs physico-chimique
• L’extraction est d’autant plus efficace que la
substance à extraire est plus soluble dans le
solvant d’extraction que dans son solvant
original.
• - Coefficient de partage
• La répartition du produit entre ces deux phases
est décrite par un équilibre de partage : K
• Cet équilibre est caractérisé par une constante

thermodynamique, le coefficient de partage
• [Aorg]éq : concentration de A dans la phase

organique à l’équilibre.
• [Aaq]éq :concentration de A dans la phase aqueuse
à l’équilibre
• A une température donnée,
• dans le cas où il n’y a aucune interaction solvant –
soluté
• et où les solvants sont parfaitement non
miscibles,
• K dépend alors des coefficients de solubilité de A
dans les deux solvants, notés SAorg et SAaq.
• On a
• - Taux de distribution D
• Dans le cas où les solvants ne sont pas
parfaitement non miscibles (légèrement
miscibles),
• le coefficient de partage ne peut pas être
directement utilisé.
• On utilise alors le taux de distribution D.
• Le taux de distribution (ou de répartition) D est le

rapport entre les concentrations totales de la
substance A dans la phase organique et dans la
phase aqueuse, quelque soit l’état dans lequel elle
se trouve.
• NB
• Dans le cas idéal où le soluté se trouve sous la même forme
dans les deux solvants, D=K
• - Rendement d’extraction ρ
• QAorg: quantité maximale de substance extraite

• QAaq : quantité initiale en solution
QAaq = QA + QAorg
• QA : quantité restante dans le solvant A à la fin de l’extraction
• mAaq : masse initiale A dans l’eau
• mA1 : masse restante A dans l’eau après une extraction
• mAorg : masse de A extraite par le solvant organique
• Avec mAaq = mAorg +mA1

• -Extractions multiples
• L’extraction simple n’offre généralement pas un
rendement satisfaisant.
• On réalise donc une ou plusieurs extractions sur le
raffiné, jusqu’à obtention d’un rendement suffisant
pour considérer que QA finale est négligeable par
rapport à Qaorg
• Démonstration
• Soit le coefficient de partage
• - Démonstration
L’expression devient
Puisque mAaq = mAorg +mA1, on peut donc écrire
D’où la masse restante en solution après la 1ere

extraction
Pour la 2e extraction, la masse restante en solution

sera donnée par la relation
• Pour n extractions, on aura

• Exemple
• Soit 100 g d’un composé dans l’eau (Vaq=50 ml),
• avec un coefficient de partage K=1
• Comparons la masse de soluté restante en solution

pour :
• 4 extractions de 50 ml=Vorg
• Et
• 2 extractions de 100 ml
• Exemple
• Vaq=50 ml et K=1
• 4 extractions avec Vorg=50 ml à chaque fois
on sait que
Pour n=4 on aura
• 2 extractions avec Vorg=100 ml à chaque fois

Pour n=2 on aura
• Exemple
• Dans les deux cas, ont utilise le même volume totale de
solvant organique.
• Il reste plus de produit dans la phase aqueuse après 2
extractions avec 100 ml de solvant
•
• Il reste moins de produit dans la phase aqueuse après 4
extractions avec 50 ml de solvant.
• Conclusion : vaut mieux extraire 4 fois avec 50 ml que 2

fois avec 100 mL de solvant.
• Exercice
• On extrait 5 fois les flavonoïdes contenus dans un
extrait aqueux (Vaq= 500 ml )
• Après évaporation de l’acétate d’éthyle utilisé
comme solvant d’extraction et pesage, la masse de
flavonoïdes extraite est mF= 78,56 g.
• Déterminer la masse (m0) de flavonoïdes

initialement dissoute dans les 500 ml d’eau.
• On suppose que le coefficient de partage k=1
• Exercice/Correction
• Vaq=500 ml et K=1
• Pour une bonne partition, le volume d’acétate d’éthyle
utilisée à chaque extraction est Vae=500 ml
• Le volume total d’acétate d’éthyle utilisé pour 5

extractions
• VT = 500x5 = 2500 ml=2,5 L
• Après 5 extractions, la masse de flavonoïde qui reste
dans l’extrait aqueux est 𝑽𝒂𝒒 𝒏
𝒎𝒓 = 𝒎𝒂𝒒 ( )
𝒌𝑽𝒂𝒆 +𝑽𝒂𝒒
• Vaq=500 ml ; K=1 ; Vae=500 ml
• Après 5 extractions, la masse de flavonoïde qui reste

dans l’extrait aqueux est 𝑽𝒂𝒒
𝒎𝒓 = 𝒎𝒂𝒒 ( )𝒏
𝒌𝑽𝒂𝒆 +𝑽𝒂𝒒
La masse de flavonoïde extraite est : mex

𝒏
𝑽𝒂𝒒 𝑽𝒂𝒒
𝒎𝒆𝒙 = 𝒎𝒂𝒒 − 𝒎𝒓 = 𝒎𝒂𝒒 − 𝒎𝒂𝒒 ( )𝒏 = 𝒎𝒂𝒒 [𝟏 − ]
𝒌𝑽𝒂𝒆 +𝑽𝒂𝒒 𝒌𝑽𝒂𝒆 +𝑽𝒂𝒒
• Vaq=500 ml ; K=1 ; Vae=500 ml
La masse de flavonoïde dans l’extraite aqueux initial

est : mF= maq
𝒎𝒆𝒙 78,56 𝟕𝟖,𝟓𝟔

𝒎𝑭 = 𝑽𝒂𝒒 = 𝟓𝟎𝟎 = = 81.09 g
[𝟏−(𝒌𝑽 +𝑽 )𝒏 )] [𝟏−(𝟏𝒙𝟓𝟎𝟎+𝟓𝟎𝟎)𝟓 ] 𝟎,𝟗𝟔𝟖𝟕𝟓
𝒂𝒆 𝒂𝒒
• NB : Pour améliorer l’extraction il faut:

• Utiliser le même volume de solvant que celui de la phase aqueuse
(1vOrg pour 1vH2O).
• Faire 2-5 extractions de la phase aqueuse.
• Vérifier par CCM qu’il ne reste plus de produit dans la phase
aqueuse.
• Modifier le coefficient de partage du produit en ajoutant un peu de
saumure (solution aqueuse saturée en NaCl) dans la phase
aqueuse.
• On appelle ce phénomène le relargage « salting-out »
• QUELQUES EXTRACTIONS SPECIFIQUES
• Il existe une multitude de méthodes permettant
d’extraire les composés naturels des plantes.
Selon la nature du composé à isoler, on choisit les
solvants et les conditions adéquates.
• Nous présentons ci-dessous quelques unes des
ces méthodes.
• Un protocole général d’extraction de métabolites

secondaires dans les plantes peut se présenter
comme suit :
Matériel végétal
homogéinisation 5 min
MeOH-H2O (4:1)
filtrer
Marc-1 Filtrat
extraction Evaporation au 1/10 du vol (<40°C)
AcOEtx5 Acidification 2M, H2SO4
filtrer Extraction avec CHCl3x3
évaportaion
à sec évaportaion
à sec
Marc-2 extrait extrait Phase
polysaccharides AcOEt CHCl3 aqueuse acide
neutre
extrait peu polaire alcalinisation pH 10, NH4OH
corps gras terpénoïdes, extraction CHCl3-MeOH
et cires phénols (3:1)x2 et CHCl3
évaportaion
à sec
Phase aqueuse basique
extrait
CHCl3-MeOH
évaportaion
extrait basique extraction MeOH
majorité des
alcaloïdes extrait
MeOH
extrait polaire
alcaloïdes
quaternaires
et N-oxides
 Extraction des triterpènes et stéroïdes
• La matière fraiche collectée doit être séchée à l’étuve (105
°C).
• Réduire le matériel végétal en poudre

• Extraire avec l’éther de pétrole, l’éther éthylique ou
l’éthanol.
• Outre les triterpénoïdes, les extraits ainsi obtenus

contiennent des alcaloïdes, des stéréoïdes, des flavones et
d’autres composés importants.
• Ils doivent être éliminés le plus tôt possible pour faciliter

l’obtention des triterpènes sous forme cristalline.
Extraction des alcaloïdes
• Principe basé sur la solubilité différentielle des
alcaloïdes bases et des alcaloïdes sels :
• - dans l’eau
• - dans un solvant organique.
• Faire des extractions liquide/liquide successives,

avec des solvants non miscibles et en faisant
varier le pH.
• Précautions !!
• - délipider d'abord la drogue (éther de pétrole,
cyclohexane, heptane), pour réduire la formation
d’émulsion
• - extraire ensuite
• - ajuster les pH
• - contrôler l’épuisement des différentes phases, avec

les réactifs de précipitation (en milieu acide)
• - agiter l’ampoule à décanter avec précaution

QUELQUES EXTRACTIONS SPECIFIQUES
Drogue moulue
+ alcool dilué + HCl dilué
évaporation de l’alcool
Marc Solution aqueuse d’alcaloïdes sels

+ alcalinisation + extraction par
solvant organique non miscible
Phase aqueuse Phase organique

(imp. hydrophiles) (alcaloïdes base)
Résidu = alcaloïdes
totaux base
Schéma : extraction des alcaloïdes en milieu acide
• Exemple 1: méthode de BRUNETON (199)
• Mélanger 5g de matériel végétal avec 125ml d’HCL à
2% et 55ml d’acétate d’éthyle
• Laisser macération l’ensemble pendant 10H.
• Filtrer et basifier la phase aqueuse acide avec
NH4OH
• Extraire (2-4) avec de l’acétate d’éthyle jusqu'à ce

que la phase aqueuse ne contienne plus d’alcaloïdes.
• Exemple : Méthode de BRUNETON (199)
• Décanter la phase organique contenant des alcaloïdes

• Eliminer les traces d’eau avec MgSO4
• Evaporer le solvant pour obtenir les alcaloïdes totaux.

Extraction des polyphénols totaux
• La plupart des phénols simples peuvent être extraits
avec méthanol/eau (80/20, v/v).
• Les phénols s’oxydent facilement
• Ajouter un réducteur au milieu d’extraction (acide

ascorbique ou métabisulfite de sodium) et à une
température de 0 à 4 °C
OH HO
HO
O OH
O ascorbic acid
• Après élimination de l’alcool sous vide (Rotavapor),
• Extraire l’extrait total obtenu par :

• - éther de pétrole (cyclohexane, hexane) : pigments
chlorophylliens, caroténoïdes
• - acétate d’éthyle : la plupart des phénols
• Exemple 1 : mélange méthanol/eau (80/20) :
(HARBONNE, 1998).
• Extraire 10 g de matériel végétal avec 100ml du mélange
(80ml méthanol + 20ml d’eau distillé)
• Exemple 1 : mélange méthanol/eau (80/20) : (HARBONNE, 1998).
(80ml méthanol + 20ml d’eau distillé).
• Laisser macérer pendant 24h avec agitation à
température ambiante à l’abri de la lumière
• Filtrer la solution après la 1ermacération
• Rajouter 100ml du solvant (80ml méthanol+ 20ml eau
distillé) et remettre à macérer pendant 24h
• Filtrer, mélanger les 2 solutions
• Eliminer le solvant par rota-évaporation
• Récupérer le résidu avec 3ml de méthanol.
• Exemple 2 : mélange acétone/eau (80/20) : (BLAHOVA,
2004).
(80ml acétone + 20ml d’eau distillé).
• Laisser macérer pendant 24h avec agitation à
température ambiante à l’abri de la lumière
• Filtrer la solution après la 1ermacération
• Rajouter 100ml du solvant (80ml acétone+ 20ml eau
distillé) et remettre à macérer pendant 24h
• Filtrer, mélanger les 2 solutions
• Eliminer le solvant par rota-évaporation
• Récupérer le résidu avec 3ml d’acétone.
Extraction des flavonoïdes
• Pour éviter toute dégradation, le matériel végétal
fraichement récolté doit être séché rapidement à l’étuve
(environ 100 °C).
• Après séchage, il pourra être stocké dans des sacs en
plastique ou réduit en poudre pour son extraction.
• Exemple 1: extraction en deux étapes

• - 1er avec le mélange Méthanol/eau (90/10, v/v)
• - 2e avec le mélange méthanol/eau (50/50, v/v)
• A chaque étape, utiliser suffisamment de solvant et
laisser macérer environ 6-12h.
• Mélanger les 2 extraits puis évaporés au tiers (1/3) du
volume initial, ou bien jusqu’à élimination totale du
méthanol.
• L’extrait ainsi obtenu peut être débarrassé des
• composés moins polaires (terpènes, chlorophylles,
xanthophylles etc.) par hexane ou chloroforme
•
• L’extrait aqueux contient les flavonoïdes polaires.
QUELQUES EXTRACTIONS SPECIFIQUES
Drogue moulue
Méthanol/eau
(90:10) puis (50 :50)
Marc Extrait hydro alcoolique

concentré au 1/3
Dégraissage :
Cyclohexane, éther pétrole,
Hexane
Phase PHASE ORGANIQUE-1

aqueuse 1 Composés lipophiles :
Terpènes, Stérols,
Extraction hydrocarbures
Dichlorométhane ou
chloroforme
PHASE ORGANIQUE-2
Terpènes, Stérols, Acide gras, Phase
hydrocarbures, Chlorophylles, aqueuse 2
polyphenol aglycone, etc
Extraction
Acétate d’éthyle
Phase aqueuse 3 PHASE ORGANIQUE-3

Polysaccharides, flavonoïdes très Flavonoïdes, glycosides
polaires, etc. cardiaques
Schéma général d’extraction des flavonoïdes

• NB :
• - ce protocole est indiqué extraire la plupart des
flavonoïdes
• pas pour les anthocyanines ou les flavonoïdes apolaires.
• - pour les anthocyanines, le matériel végétal ne doit pas
être séché, mais extrait frais avec MeOH à 1% de HCl (c).
• La coloration de l’extrait indique le succès de

l’extraction. L’extrait doit être rapidement traité pour
éviter toute hydrolyse des glycosides.
• Exemple 2: méthode de DAUGUET et FAUCHER (1982)
• 5g de matériel végétal dans 100ml de méthanol a faire
bouillir avec 2,5 gr de CaCO3.
• Maintenir l’ébullition sous réfrigérant a reflux pendant

1h,
• Filtrer et extraire le dépôt de nouveau pendant 1h à

ébullition dans la même quantité d’alcool.
• Rassembler les 2 solutions
• Exemple 2: méthode de DAUGUET et FAUCHER (1982)
• Eliminer le solvant par distillation sous pression réduite

• Reprendre le résidu par 100ml d’eau distillé bouillante
• Filtrer à chaud et épuiser le filtrat successivement par

l’éther d’éthylique, l’acétate d’éthyle et le n-butanol
Extraction des saponines
• Afin de suivre de près l’extraction des saponines du

matériel végétal,
• on emploi le teste d’hémolyse et l’analyse
chromatographique.
• Les saponines possèdent des propriétés physico-
chimiques et biologiques assez différents,
• cela rend impossible leur isolement par une méthode

unique.
Extraction des saponines
• Il est toute fois possible de procéder à leur extraction
• Traiter le matériel végétal avec de l’éther de pétrole
pour éliminer les graisses, les résines et les
chlorophylles.
• On extrait ensuite le Marc avec l’éthanol ou méthanol
à 50% ou 90%.
• Les extraits obtenus sont légèrement concentrés puis
introduits goutte à goutte dans l’éther à froids (- 5°C)
ou dans l’acétone.
• La saponine précipitée est lavé avec l’éther (3x)
METHODES
CHROMATOGRAPHIQUES
• INTRODUCTION
• La chromatographie a été inventée par le botaniste
russe Mikhail Tswett peu après le début du XXe
siècle.
• Le nom de «chromatographie» (Grec ancien chroma
signifiant «couleur» et graphie «écrire»).
• Méthode analytique largement utilisée pour la

séparation, l’identification et le dosage des
constituants chimiques dans des mélanges
complexes.
• INTRODUCTION
• Le principe repose sur l'équilibre de concentrations des

composés présents entre deux phases en contact:
• - la phase stationnaire (emprisonnée dans la colonne)
• - et la phase mobile qui se déplace
• Les séparations par chromatographie sont basées sur

des propriétés physiques des constituants à séparer:
• - la solubilité de la molécule
• - la tendance la molécule à se lier à un solide
(adsorption)
• - la volatilité de la molécule
• INTRODUCTION
• Les deux grands types de chromatographie:

• - la chromatographie en phase gazeuse (GC)
• - la chromatographie en phase liquide (LC)
• La LC regroupe:
• la chromatographie sur colonne à pression
atmosphérique (CC),
• - la chromatographie sur couche mince (CCM),
• -la chromatographie liquide haute performance (CLHP
ou HPLC en anglais)
• -la chromatographie d’échange d’ions, etc.
• INTRODUCTION
• La chromatographie peut être analytique ou préparative.

• La chromatographie analytique vis au analyses
qualitatives et/ou quantitatives.
• On associe la chromatographie à d’autres techniques
analytiques chimiques ou physico-chimiques : c’est le
couplage.
• La chromatographie préparative est utilisée lorsque l’on
désire purifier un produit, soit à l’issue d’une synthèse,
soit dans le but d’utiliser d’autres techniques
analytiques, comme la RMN.
• LES DEUX PHASES EN CHROMATOGRAPHIE
• Le mécanisme de séparation en
chromatographie s’explique par les différences
de répartition des molécules d’un mélange
entre deux phases non-miscibles :
• la phase mobile
• et la phase stationnaire
Coefficient de partage K
• Les molécules passant continuellement d'une phase à
l'autre;
• Cela crée un état d'équilibre entre la phase mobile et la
phase stationnaire pour un constituant en particulier.
• À ce moment le rapport des concentrations est égal au
rapport des répartitions dans les deux phases ou
coefficient de partage K.
Coefficient de partage K
• Plus K est grand, plus le composé est absorbé

fortement dans la phase stationnaire et plus la
rétention est grande et inversement.
• La valeur de K dépend de la:
• - structure du composé
• - nature de la phase stationnaire
• - phase mobile, seulement si c’est un liquide, et donc
un solvant pour chacun des composés
• - température qui affecte les pressions de vapeur et les
solubilités
La phase stationnaire (adsorbant)
• La phase stationnaire en chromatographie est en
général un solide poreux ou solide-liquide.
• La phase stationnaire en chromatographie de partage
doit être chimiquement inerte, c'est-à-dire qu'elle ne
doit réagir avec aucun des constituants du mélange au
cours de la séparation
• Exemple : Gel de silice, oxyde d’aluminium, Séphadex

LH-20, etc.
La phase mobile (éluant)
• La phase mobile ou éluant peut être un gaz (gaz
vecteur) ou un liquide (solvant) :
• -Si la phase mobile est un gaz elle ne sert qu’à
entraîner les constituants à travers la colonne.
• Le passage des constituants vers la phase mobile ne
dépend pas de leur solubilité mais de leur pression de
vapeur.
• -Si la phase mobile est un liquide, elle a un double rôle:
entraîner les composés à travers la colonne et
solubiliser les constituants du mélange.
Deux grands types de chromatographie
• Il existe deux grands types de chromatographie, en

fonction de la phase mobile utilisée et aussi selon les
mécanismes de séparation:
• 1- la chromatographie en phase gazeuse (GC)
• 2- la chromatographie en phase liquide (LC) qui

regroupe :
• -la chromatographie sur colonne (CC),
• -la chromatographie sur couche mince (CCM),
• -la chromatographie liquide haute performance (CLHP,
HPLC en anglais)
• -la chromatographie d’échange d’ions.
Chromatographie sur couche mince
• La chromatographie sur couche mince (CCM)
• En angalis Thin layer chromatography (TLC)
• est une technique d’analyse qualitative et de
purification.
• La CCM analytique permet d’identifier un

composé, de vérifier sa pureté, de suivre
l’avancement d’une réaction ou de choisir le
meilleur système d’élution pour une
chromatographie sur colonne.
• La CCM préparative permet de séparer ou purifier un
produit.
• Une plaque de CCM est un support en verre, en

aluminium ou en plastique sur lequel a été étalée une
phase stationnaire en couche uniforme.
• On ajoute souvent un pigment fluorescent pour

permettre une détection des produits à la lumière
ultraviolette à 254 nm ou 366 nm.
• Description de la CCM
• Une plaque CCM est un support en verre, en
aluminium ou en plastique sur lequel a été étalée
une phase stationnaire en couche uniforme.
• L'épaisseur de cette couche est de l'ordre de 0,2
mm (200 μm) pour une plaque analytique et 1-3
mm pour une plaque préparative.
• On ajoute des additifs pour permettre à la plaque

d’être révélée sous UV 254 ou 365 nm
• Principe de la technique
• Considérons un mélange de composés que l’on
souhaite séparer ou analyser lors d’une CCM.
• L’échantillon solubilisé est déposé sur un solide
poreux adsorbant appelé phase stationnaire qui
recouvre une plaque rigide inerte.
• La partie inférieure de cette plaque est mise en

contact avec un solvant appelé phase mobile qui
monte par capillarité
• Principe de la technique
• Lors de l’élution, les composants du mélange migrent

plus ou moins haut sur la plaque du fait de la
compétition entre trois phénomènes :
• - l’adsorption des composés sur la phase stationnaire ;
• - la solubilisation des composés dans l’éluant ;
• - l’adsorption de l’éluant sur la phase stationnaire
• Ces trois phénomènes sont gouvernés par des

interactions faibles de type interactions de Van der
Waals et liaisons hydrogène.
• Application
• Tracer un trait horizontal sur la plaque, à 1 cm du bas (ligne de
départ)
• et un autre à 1 Cm du haut (front).
• L’échantillon à migrer doit être déposé sur le trait du bas.
• Application
• Rapport frontale
• Une substance peut être caractérisée par son Rf.
• Cette valeur permet d’estimer sa polarité.
• Dans un solvant d’élution donnée, plus le Rf est
grand, plus la polarité du composé est faible.
• Le Rf est toujours compris ente 0 et 1.
distance de migration de la substance
Rf =
distance de migration du front de solvant
• Le rôle principal de la CCM est analytique

Calcul de Rf
• Le chromatogramme obtenu dans un éluent quelconque.
• Les échantillons F1, F2 et F3 ont été déposés sur la ligne
de départ.
Calcul de Rf
Echantillons F1 : renferme au moins deux composés A et
B. le composé A migre plus que B, donc A est moins
polaire que B
Calcul de Rf
Echantillon F2 : renferme au moins 2 composés (C et D).
Le composé C est moins polaire que D
• Exemple de calcul de Rf
• Echantillons F3 : au moins un composé E (qui n’a presque
pas migré). Ce groupe de composé est trop polaire pour
l’éluent ; raison de leur faible migration
• Les composés B et C ont le même Rf dans le même
système d’élution ; on en déduit que B et C sont
identiques
• LA CHROMATOGRAPHIE SUR COLONNE (CC)
Généralité
• En chromatographie sur colonne, la phase
stationnaire est placée dans un tube cylindrique en
verre, fermé à une extrémité par une valve ou un
robinet, l'autre est ouverte.
•
• Les dimensions de la colonne sont telles que la
hauteur du support est égale à sept fois le diamètre
de la colonne.
• Le diamètre de la colonne est choisi en fonction de
la quantité de l’échantillon à purifier.
Principe
• La séparation par CC repose sur les mêmes principes
que la séparation par CCM
• A savoir les affinités relatives des composés à séparer
pour une phase mobile et une phase stationnaire.
• Lors d’une chromatographie sur colonne, l’adsorbant

placé dans la colonne constitue la phase stationnaire
tandis que l’éluant qui se déplace par gravité (et parfois
sous l’effet d’une surpression) constitue la phase
mobile.
• Eluant : mélange de solvants
permettant de faire migrer le
Eluent
produit à travers la phase
stationnaire.
•
Colonne
• Phase stationnaire : ici c’est la
silice
Echantillons à séparer
•
Silice ou
phase stationnaire
• NB :
Hauteur de
la colonne - Plus l’éluent est polaire, plus la
migration à travers la colonne
sera rapide.
Robient - Pour choisir le meilleur système
d’élution, il faut faire des essais
sur plaque CCM. Le système qui
permet une meilleur séparation
collecte des fractions des constituants du mélange doit
être utilisé pour la séparation sur
colonne chromatographique.
Protocole
• Après avoir déposé l’échantillon (solubilisé ou non) sur
la colonne constituée par la phase stationnaire
• Le mélange de solvant d’élution est délicatement versé

sur l’échantillon pour provoquer la séparation.
• L’éluant chargé du composé isolé est alors recueilli au

bas de la colonne.
Choix du meilleur système d’élution
• Avant d’entreprendre une chromatographie sur
colonne, des CCM sont réalisées avec des éluants
différents afin de déterminer les conditions de
séparation optimales.
• Une bonne séparation nécessite que :

• – les composés ne migrent pas au-delà du premier tiers
(1/3) de la plaque;
• – les taches soient suffisamment séparées.
 Choix du meilleur système d’élution
• Considérons les 3 exemples de chromatograme réalisées dans
trois éluants différents avec la même phase stationnaire
• Chromatogramme (1) : les taches sont nettement séparées

tout en restant dans le premier tiers de la plaque : l’éluant
utilisé est adapté pour réaliser la chromatographie sur
colonne
Choix du meilleur système d’élution
• Chromatogramme (2) : les taches sont encore dans le

premier tiers de la plaque mais elles sont peu séparées.
• La séparation sur la colonne est possible mais risque
d’être plus difficile et va nécessiter d’augmenter la
quantité d’adsorbant (silice) par rapport au cas (1)
 Choix du meilleur système d’élution
• Chromatogramme (3) : les composés sont trop peu retenus

par la phase stationnaire.
• La migration dans la colonne risque d’être trop rapide pour
que la séparation soit efficace (les constituants du mélange
ne vont pas avoir le temps de se séparer avant de sortir de la
colonne).
• L’éluant utilisé est trop polaire et doit être changé.
 Mélange de solvants et gradient de polarité
• Si l’éluant est un mélange de solvants,
• la séparation peut être réalisée soit en utilisant le même
mélange tout au long de l’élution,
• soit en augmentant graduellement la polarité de l’éluant
au cours de l’élution:
• on réalise alors un gradient de polarité.
• Cette méthode permet de mieux entraîner,

successivement, l’ensemble des composés présents
dans le mélange.
• CHROMATOGRAPHIE PHASE GAZEUSE (GPC)
• La séparation basée sur la distribution des solutés d’un
mélange entre 2 phases:
• ‐phase stationnaire (solide)
• ‐phase mobile (liquide, gaz)
Principe
• La CPG est réservée à l’analyse de composés
relativement volatils ou vaporisables par
chauffage et thermiquement stables.
Composition du Système CPG
• La CPG est très sensible et elle est constituée de trois
modules:
• - un injecteur,
• - une colonne capillaire dans un four
• - un détecteur.
• Il existe différents types de détecteurs (FID, ECD, TCD…).
• FID : détecteur à ionisation de flamme (Flame Ionization
Detector).
• ECD : détecteur à absorption électronique
• (Electron Capture Detector).
• TCD : détecteur à conductivité thermique (Thermal
Conductivity Detector)
CHROMATOGRAPHIE PHASE GAZEUSE (GPC)
Système CPG
Injecteur
• Il sert à l’introduction du mélange à analyser dans la
colonne à l’aide :
• - d’une micro seringue pour les liquides et les solutions,
• - d’une vanne à boucles pour les mélanges gazeux
• En règle générale, la chambre d’injection doit être à une

température plus élevée que celle de la colonne pour
faciliter l’évaporation des échantillons
Injecteur
• La température idéale est celle qui est 20°C plus élevée
que le point d’ébullition de la substance la moins
volatile.
• Le choix de l’injecteur est dicté par le type de colonne
utilisée (remplie ou capillaire) et par la nature des
produits à séparer.
Colonnes
• Il existe deux types de colonnes avec des variantes :
• - colonnes remplies ou à garnissage (packed);
• - colonnes capillaires (open tubular).
Détecteurs
• Le détecteur comme le nom l’indique, permet de
détecter le passage des molécules séparées ou non. On
distingue différents types de détecteurs :
• - détecteur à conductibilité thermique (TCD)
• - détecteur à ionisation de flamme (FID)
• - détecteur à absorption électronique (ECD)
Chromatogramme
• L’analyse CPG des arômes contenus dans une barre chocolatée
CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE
(CLHP ou HPLC)
• High Performance Liquide Chromatographie, en anglais
(HPLC en Anglais)
• HPLC est couramment utilisée pour l’analyse et
l’isolement de composés naturels
Principaux modules
un système de pompage
- un injecteur
- une colonne
- un détecteur
• CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE
(CLHP ou HPLC)
Le système de pompage
• Le système de pompage est la partie du
chromatographe qui permet de prélever l’éluant, d’en
réguler le débit et de maintenir la pression de
l’ensemble.
• Sur une chaîne HPLC classique, le système de pompage
est capable de refouler le liquide jusqu’à une pression
de 400 bars.
• En pratique, la pression de travail est généralement
comprise entre 100 et 250 bars.
(CLHP ou HPLC)
• Un système de pompage peut être utilisé soit en
mode isocratique, soit en gradient d’élution
• Mode isocratique
• Ce mode d’élution ne nécessite pas de temps de
rééquilibrage de la colonne HPLC entre deux
analyses.
• Il consiste à faire débiter par la pompe les mêmes
proportions de solvant A et B sur toute la durée de
l’analyse,
• ou éventuellement de n’utiliser qu’un seul réservoir
de solvant.
(CLHP ou HPLC)
- Gradient d’élution
• C’est une variation des proportions des constituants du
mélange éluant.
• Pour appliquer un gradient d’élution, il faut au
minimum deux solvants et une chambre de mélange
• Ce mode d’élution est généralement préféré pour les
analyses de mélanges complexes car il permet de
réduire le temps d’analyse tout en conservant une
séparation satisfaisante des analytes.
(CLHP ou HPLC)
L’injecteur
• Il s’agit d’une boucle d’échantillonnage montée
sur une vanne d’injection.
• En pratique, dans le cadre d’un couplage LC/MS,
• l’injecteur est toujours couplé avec un passeur

d’échantillons.
(CLHP ou HPLC)
La colonne
• La colonne est le cœur du système HPLC
• C’est en grande partie d’elle que dépend la qualité
de la séparation chromatographique
• Une colonne HPLC est caractérisée par

• sa phase stationnaire,
• sa longueur,
• son diamètre
• et la taille de ses particules.
(CLHP ou HPLC)
La colonne
• une colonne HPLC a des dimensions comprises entre
• 5 et 30 cm pour la longueur,
• 1 et 4,6 mm pour le diamètre
• et 3 à 5 μm pour la taille des particules.
• Le débit de solvant est adapté en fonction du diamètre

de la colonne :
• - 20 à 100 μL/min pour une colonne de 1 mm de diamètre,
• - 0,5 à 2 mL/min pour une colonne de 4,6 mm de diamètre
(CLHP ou HPLC)
Phase stationnaire
• Le choix de la phase stationnaire est beaucoup plus
vaste.
• On distingue:
• -les colonnes normales et
• -les colonnes en phase inversée (reversed phase RP).
• C’est la Phase inversée (reversed phase ou RP) qui est la
plus utilisée
• Elle doit son nom au fait qu’elle est l’inverse d’une

chromatographie dite normale
(CLHP ou HPLC)
Phase stationnaire
• Elle permet de faire migrer les composés par polarité
décroissante.
• Les plus polaires sortent en tête de colonne
• Les moins polaires sortent en queue de colonne
• Ainsi, les substances les plus polaires sortent en tête de

colonne et les apolaires sont retenues plus longtemps.
(CLHP ou HPLC)
Les détecteurs
• Il existe différents types de détecteurs.
• - détecteur par spectrophotomètre UV-visible,
• - détecteur par spectrofluorimètre,
• - détecteur par réfractomètre différentiel,
• - détecteur à diffusion de lumière
• - etc.
• Le spectromètre de masse permet à la fois de caractériser et

de quantifier un analyste.
• La détection se fait à l’aide d’un spectromètre Infra rouge.
(CLHP ou HPLC)
Les détecteurs
• Les spectres infra rouge sont traditionnellement divisés en

plusieurs régions.
Infra rouge (IR) 2500 – 50000 nm
Proche infra rouge 800 – 2500 nm
Visible 400 – 800 nm
Ultra violet (UV) 190 – 400 nm
• Trois régions sont très utilisées en spectrométrie : IR, Visible

et UV
• La majorité des composés organiques peuvent être analysés
par des détecteurs UV/VIS.
-10
100
110
120
130
140
150
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0
160 mAU
3.12 3.25
3.43
3.69
4.40
5
10
15
16.83
procyanidin B1 (17.51min)
20
22.65
p-coumaric acid (24.00min)

iso-scopoletin (24.53min)
25
27.23 ferulic acid (26.52min)
epicatechin gallate (27.72min)
30
35
Chromatogramme HPLC
40
42.93
45
46.77
49.43
50
50.04 50.23
50.71 xanthotoxin (50.92min)
kaempferol (51.25min)51.84 51.45 51.57
52.15
52.43 52.68
52.89 trioxalen (52.92min)
53.64
54.16 apigenin ?? (54.29min) 53.83
54.79 55.03
55
55.53
56.12 56.27
CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE (CLHP ou HPLC)
57.31
57.71
PA23180610.DATA [PDA-Channel-1 ]
RT [min]
60
(CLHP ou HPLC)
 GRANDEURS EN CHROMATOGRAPHIE
• Les grandeurs utilisées en chromatographie pour
caractériser une méthode de séparation concernent
essentiellement la colonne.
• Considérons l’expérience qui permet d’obtenir la
courbe de Gauss.
• Au moment de l’injection, de durée (dt), le "futur"

pic de chromatographie a un profil rectangulaire.
(CLHP ou HPLC)
 GRANDEURS EN CHROMATOGRAPHIE
• A la sortie de la colonne, il se retrouve déformé
suivant une loi statistique approximativement
« normale », c'est une courbe de Gauss.
• L'équation mathématique y=f(t) de la courbe de
Gauss est :
• Une courbe de Gauss est caractérisée par les

paramètres suivants:
• -Écart-type s. L'écart type s correspond à la

moitié de la largeur du pic mesuré à 60,6% de sa
hauteur
• - Variance = s2
• - Largeur à mi-hauteur δ mesurée à h/2.
• On a la relation: δ = 2,35s [1]
• La "base" du pic ω. extrapolée par des

tangentes aux deux branches et passant par les
points d'inflexion de la courbe de Gauss.
• ω = 4s [2].
Temps de rétention tr
• Le temps de rétention d’une substance, c’est le
temps que met celle-ci pour traverser la colonne
après son injection.
• Il dépend de plusieurs facteurs :
• - la nature de la phase stationnaire,
• - la nature de la phase mobile,
• - le débit de la phase mobile,
• - la longueur de la colonne
• Soit la séparation de deux composés par
chromatographie de partage.
tm(to): temps mort; temps mis par les composés non retenus pour traverser la colonne
tR: temps de rétention; temps mis par les composés retenus pour traverser la colonne
t’R: temps de rétention corrigé: temps pendant lequel le composé est retenu sur la colonne
h: hauteur du pic
w: largeur du pic à la base
Facteur de capacité k’
• Il exprime le rapport de la quantité de soluté dans la
phase stationnaire à la quantité de soluté dans la phase
mobile.
• Il est sans dimension et peut être relié au temps de
rétention.
• Il a l’avantage de ne dépendre ni du débit ni de la
longueur de la colonne.
• Il est facilement calculé pour une substance.
Facteur de sélectivité 
• Le facteur de séparation,
• sans dimension,
• Il est égal au rapport des facteurs de capacité de deux
solutés dont on veut réaliser la séparation.
• Il permet de caractériser la distance qui sépare le
sommet de deux pics chromatographiques consécutifs 1
et 2.
• Séparation de 2 solutés A et B
• Chromatogramme d'un mélange de 2 produits A et B sur une colonne CPG
• NB:
• Si =1, les deux pics sont superposés
• Si >1, les deux pics sont séparés
Résolution R ou Rs
• La résolution mesure la qualité d’une séparation.
• Deux caractéristiques déterminent le degré de
recouvrement des pics: la distance séparant les
sommets de 2 pics mesurée par tr2 - tr1 et la largeur des
pics à la base w.
• Le facteur de résolution R de 2 pics est déterminé selon

les relations ci-dessous: 𝒕𝒓𝑩 − 𝒕𝒓𝑨
avec la largeur à mi-hauteur d: 𝐑 = 𝟏, 𝟏𝟖(
𝝳𝐀 + 𝝳𝐁
)
avec la largeur des pics à la base:
avec le volume de rétention:

• Considérons le chromatogramme ci-dessous
• Pour des valeurs de R très grandes:

• - la séparation des pics n’est pas meilleure
• - le temps de la séparation devient long.
• Contrairement à la sélectivité (),
• La résolution (R) prend en compte la forme des pics et
leur recouvrement éventuel.
• Considérons la séparation de deux solutés A et B
• Pour R<0.6, les pics ne sont pas séparés.

• Pour une bonne résolution il faut que R ≥ 1,25
Nombre de plateaux théoriques N
• Paramètre qui sert à mesurer la performance
d’une colonne à distillation fractionnée.
• Une colonne de N plateaux théoriques est une

colonne divisée en N petits disques cylindriques
successifs.
Nombre de plateaux théoriques N
• On admet que la phase mobile progresse par sauts
successifs d'un plateau théorique à l'autre.
• Dans chaque plateau théorique,
• on observe une rétention du soluté S, du fait de
l'équilibre de ce produit entre la phase mobile et la
phase stationnaire.
• En fonction du temps de rétention
• Connaissant la largeur à mi -hauteur
NB!! tr-tm= t’r =temps de rétention corrigé

 Nombre de plateaux théoriques N
• Efficacité H : L’efficacité d’une colonne est caractérisée

par son nombre de plateaux théoriques N.
• L'efficacité d'une colonne de longueur L
• et de N plateaux théoriques,
• est définit par la hauteur H équivalent à un plateau

théorique
 Nombre de plateaux théoriques N
• H est appelé la hauteur équivalente à un

plateau théorique (HEPT),
• ce paramètre varie entre 10 et 0,01 mm
• N augmente avec le temps de rétention et

diminue si la largeur des pics (s) augmente.

Presentation - M2-Chimie-Univac - 2022-2023

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Université Félix Houphouët Boigny Ecole Normale Suprérieure

COMPOSES ORGANIQUES NATURELS

• Les recueils de plantes actives constituent souvent les

• La synthèse des métabolites par la plante est un processus

• Règne animal: utilisation d’organes ou produits

• Une classe très hétérogène car très peu de rapport

• Une classe très hétérogène car très peu de rapport

Acide palmitique : CH3-(CH2)14-COOH

• avec n=24,26 et m= 29,31

n=1 C5H8 Hémiterpènes

geraniol menthol limonène (-)menthol -pinène Campjre

Sesterpène C25 Triterpène C30

acide gascavelique H CH3

• Exemples: acide biliaire, stérols, hormones

• Les stéroïdes sont largement distribués dans la

• On les trouve aussi bien à l’état libre comme sous

• Très souvent, ils se trouvent sous la forme d’un

Fumaria officinalis Alstonia bonei

• Cardénolide : ce sont des stéroïdes à C23 ayant un

• Bufadiènolide : ce sont des stéroïdes à C24 ayant

• Les glucides divisent en OSES et OSIDES

• Les glucides existent naturellement sous deux

• 2. Forme cyclique: Projection de HAWORTH

Glucose OH Galactose OH OH Fructose

• Difficile de les présenter sous un seul noyau

• - suivant leurs structures chimiques,

Papaver somniferum L (Opium)

• Le terme «polyphénols» désigner l’ensemble des

• Composés très diversifiés,

C6 Phénols simples Catéchol

C6-C1 Acides hydroxybenzoïques p-hydroxybenzoïque

C6-C3 Acides hydroxycinnamiques Acides caféique

C6-C4 Naphtoquinones Juglone

C6-C2-C6 Stilibènes Resvératrol

C6-C3-C6 Flavonoïdes Quercétine

(C6-C3)2 Lignanes Pinorésinol

Les formes simples des phénols

C6-C1 : Acides hydroxybenzoïques

C6-C2-C6 : Stilibènes C6-C4 : Naphtoquinones

• Les flavonoïdes se divisent en plusieurs sous-classes

• Au sein d’une même sous-classe, les possibilités de

• La structure commune aux anthocyanines est l’ion

• Le noyau flavylium peut se protonner facilement

• Présentes dans toutes les parties des végétaux

• Ils jouent dans la plante le rôle d'armes chimiques

• Exemple de tannin hydrolysable

• Les tanins condensés sont très abondants dans

• Sous forme de sel d’hydroxyquinones, ils prennent la

CH3 CH3O CH3

• Toutes les coumarines sont substituées en C-7

• Les divers groupes hydroxyles en C-6, C-7 et C-8,

• - Révélation en UV : Si la plaque est

• - Révélation par atomisation: Cette technique utilise un

• La CCM analytique permet d’identifier un

• La CCM préparative permet de séparer ou purifier un

• On ajoute souvent un pigment fluorescent pour

distance de migration de la substance

• Le rôle principal de la CCM est analytique

• Identification des dérivés stéroïdiques

• Phytomolécules ayant le noyau

Attention!! Les diterpènes réagissent aussi à ce test

• Identification des sapogénines stéréoïdiques et des stérols

 Test au chlorure de zinc