1 biochimie

1.1 bilan glucidique

La glycémie correspond à la quantité de glucose dans le sang. Elle est souvent exprimée en
grammes par litre de sang. Ainsi, le bilan glycémique permet d’évaluer ou de mesurer ce taux de
sucre et vous permet aussi de comprendre si votre système de régulation fonctionne normalement.
De ce fait, il doit être constamment effectué par les patients diabétiques, mais également pour
jauger les risques de maladies cardiovasculaires. De ce fait, mieux comprendre son bilan
glycémique permet de savoir si l’on a une glycémie équilibrée ou si l’on souffre d’hyperglycémie
ou d’hypoglycémie.

Glycémie normale
Elle varie en fonction des moments et des repas. La glycémie normale à jeun le matin (après un
jeune de 8 h) doit être régulée et maintenue à un taux relativement compris
entre 0.70 et 1.10 g/l soit 3.9 à 5.5 mmol/l. Mais elle doit être inférieure
à 1.40 g/l soit 7.8 mmol/l, après les deux heures qui suivent un repas (Taux de glycémie post –
prandiale). Ainsi, il faut noter que le bilan glycémique doit être à peu près le même chez les
patients.
Cependant, si la glycémie à jeun est :

 moins de 0.70 g par litre de sang, on parle d’hypoglycémie

 plus de 1.10g par litre de sang, on parle d’hyperglycémie
 plus de 1.26g par litre de sang, il y a un risque de diabète
Glycémie basse
La glycémie est basse lorsqu’elle est au-dessous de 0.70 g par litre de sang. Une baisse excessive
de la glycémie dans le sang constitue un état d’hypoglycémie. En effet, à l’extrême,
l’hypoglycémie peut entrainer des complications telles qu’un malaise ou une perte de conscience.
Si aucun soin n’est apporté (apport de sucre, boisson sucrée) la mort peut survenir. Vous pouvez
savoir sur ce lien, pourquoi il est important de venir à jeun.
L’hypoglycémie se manifeste souvent par des symptômes visibles tels que :

 Une fatigue extrême

 Des tremblements fréquents
 De la sueur en abondance
 De la somnolence
 Des anomalies du champ visuel
 Des étourdissements
Comprendre son bilan glycémique : cas d’une glycémie élevée
On parle de glycémie élevée ou hyperglycémie lorsque le niveau de sucre dans le sang est au-
dessus de la valeur normale, en fonction des moments de la journée. La glycémie est élevée
lorsqu’elle atteint 1.26 g/l, soit 7 mmol/à jeun. Mais ce chiffre est normal si l’on fait l’analyse
dans les deux heures qui suivent un repas.
 Entre 1.10 g et 1.25 g soit 3.9 et 5.5 mmol par litre de sang, on parle d’hyperglycémie
modérée,
 Si le taux de glycémie est supérieur à 1.26 g par litre de sang, on parle
de prédiabète ou diabète dès qu’on franchit ce seuil.
Les symptômes
Chez certaines personnes, l’hyperglycémie peut passer inaperçue. Cependant, au-delà d’un certain
seuil, une glycémie trop élevée peut conduire à l’apparition des symptômes suivants :
 Fatigue
 Urines abondantes
 Soif intense
 Faim exagérée
 Perte de poids involontaire
 Irritabilité
 Étourdissements
Les causes d’une Hyperglycémie
Les principales causes sont :

 Une alimentation plus riche en sucre (boissons, sucre lent (riz, pâte alimentaire) qu’à
l’habitude
 Une diminution de l’activité physique
 Une insuffisance d’insuline et/ou de médicaments antidiabétiques (erreur de dosage ou oubli
d’une dose)
 Un stress physique (maladie, chirurgie, infection, etc.) ou psychologique (deuil, nouvel emploi,
déménagement, etc.)
 La prise de certains médicaments (ex. : corticoïdes)
 Prédisposition familiale
Comment surveiller son bilan glycémique ?
Le bilan glycémique se surveille soit :

 au laboratoire d’analyse médical : pour connaitre son bilan glycémique tous les trois mois :
c’est la glycémie veineuse,
 avec un glucomètre : pour surveiller plusieurs fois son bilan glycémique chaque jour, à des
moments bien précis : c’est la glycémie capillaire.
Il est conseillé de bien surveiller sa glycémie. Cela permet de remarquer rapidement les
complications qui risquent de survenir en cas de variation de la glycémie et de limiter leur
aggravation grâce à une prise en charge adaptée.

Conclusion
Le bilan glycémique varie d’un patient à l’autre en fonction des moments de la journée sous
l’influence de plusieurs facteurs : régimes alimentaires, activités physiques, émotions et
l’influence des hormones. Le bilan glycémique doit être effectué régulièrement pour surveiller le
niveau de sucre dans le sang. En effet, les chiffres doivent être considérés avec
prudence. Donc, seul un prélèvement de sang analysé en laboratoire permet de déterminer avec
certitude votre état de santé. Comprendre son bilan glycémique est une grande étape pour prévenir
certaines complications

2.1 vitesse de sédimentation

La vitesse de sédimentation est chez la personne normale de quelques millimètres par heure.
Elle peut dépasser 100 mm/h dans certains cas.
Elle est régulièrement augmentée dans un syndrome inflammatoire (rhumatisme, artérite
temporale ou maladie de Horton, syndromes infectieux...).
Elle peut être également élevée en cas d'anémie ou de grossesse.
Ce test, simple de réalisation mais peu spécifique, tend à être remplacé par des dosages plus
fiables :

 protéine C réactive,
  fibrinogène.
La mesure de la viscosité plasmatique repose sur les mêmes principes mais ses résultats sont
indépendants du sexe et de la présence ou non d'une anémie ou d'une polyglobulie 2.
Définition :
La vitesse de sédimentation est un test qui mesure le taux de sédimentation, ou chute
libre des globules rouges (hématies) dans un échantillon de sang laissé dans un tube
vertical, au bout d'une heure. Cette vitesse dépend de la concentration des protéines dans
le sang
Utilité
La vitesse de sédimentation peut être calculée dans plusieurs situations, notamment pour :
rechercher une inflammation. évaluer le degré d'activité de certaines maladies
inflammatoires rhumatismales comme la polyarthrite rhumatoïde.
Valeur normale
Après une heure de sédimentation des globules rouges dans un tube vertical, la
hauteur normale de sérum est inférieure à 15 mm chez l’homme et 20 mm chez
la femme pour les plus jeunes adultes. Ces valeurs passent respectivement à 20
mm et 25 mm chez les plus de 65 ans.

La vitesse de sédimentation augmente :

 Avec l'âge
 Au cours de la grossesse
 Dans les infections chroniques et aiguës
 Dans les maladies rhumatismales : arthrose, rhumatisme articulaire
aigu, polyarthrite rhumatoïde, lupus
 Dans les dysglobulinémies : maladie de Kahler et de Waldenström
 Dans les lymphomes : maladie de Hodgkin
 Dans les syndromes néoplasiques et cancers
 Dans les maladies dégénératives.


2.2 GROUPAGE SANGUIN

Un groupe sanguin est une classification reposant sur la présence ou l'absence de
substances antigéniques héritées à la surface des globules rouges (hématies). Ces
antigènes peuvent être des protéines, des glucides, des glycoprotéines ou
des glycolipides, selon le système de groupe sanguin, et certains de ces antigènes sont
également présents à la surface d'autres types de cellules de différents tissus.
 Les divers groupes sanguins sont regroupés en systèmes. Appartient à un même
système de groupes sanguins l'ensemble des épitopes ou phénotypes résultant de
l'action des divers allèles d'un même gène ou de gènes étroitement liés.
  Le sang est un tissu liquide que l’on peut facilement prélever sur un individu sain pour le
transfuser à un individu malade. Or, malgré une composition cellulaire identique de ce
tissu, il existe une variabilité, ou polymorphisme des divers éléments du sang entre les
individus, ce qui rend impossible la transfusion entre certains groupes de personnes. On
dit des personnes qui présentent une même caractéristique qu’elles appartiennent au
même groupe sanguin. En règle générale, ces caractéristiques sont mises en évidence
par des techniques d'hémagglutination grâce à des anticorps ou
des lectines reconnaissant spécifiquement un épitope. En cas de problème, il peut être
fait appel à la biologie moléculaire. Ces épitopes, déterminant divers phénotypes,
sont génétiquement transmis
 Qu’est-ce qu’un groupe sanguin ?
 D’emblée, il faut au préalable cerner les notions d’antigènes, et groupe ABO.
Ainsi, un antigène est une substance microscopique qui est étrangère à
l’organisme et donc susceptible de déclencher une réaction immunitaire, qui
est la production d’anticorps chargés de les neutraliser (les antigènes).
L’antigène peut être une protéine, un glucide, une glycoprotéine ou un
glycolipide. Le système ABO a été découvert en 1900-1901.
 Une personne est de groupe sanguin A, s’il y a la présence dans son sang de
l’antigène A. Il en est de même pour les personnes de groupe B. Pour les
personnes du groupe sanguin AB, cela s’explique par la présence des
antigènes A et B en même temps sans pour autant que cela soit considéré
comme une maladie. Le groupe sanguin O est caractérisé par la spécificité
selon laquelle les personnes de ce groupe n’ont aucun des antigènes précités
dans leur sang.
La méthode la plus recommandée et qui est plus couramment utilisée est la
prise de sang. Sur prescription de votre médecin ou de votre propre initiative,
vous pourrez vous rendre dans un laboratoire ou un centre médical pour
faire un test de groupe sanguin. À la suite de cette séance, une carte de
groupe sanguin vous sera délivrée en principe. Cette carte revêt une
importance capitale puisqu’elle permet au personnel des hôpitaux d’identifier
rapidement votre groupe sanguin lors d’un accident ou s’il y a une demande
urgente de sang du même groupe que le vôtre.

Pourquoi est-il bien de connaitre son groupe sanguin ?

D’abord, l’importance tient du fait des besoins de transfusion sanguine. Dans cette
situation, il est nécessaire que la compatibilité entre donneurs et receveurs soit
établie. Le contact d’anticorps et d’antigènes de même type risque d’engendrer un
rejet ou une coagulation du sang. Dans tous les cas, il est important pour une
personne de connaitre son groupe sanguin, cela l’aide beaucoup lors d’une
transfusion sanguine ou lorsqu’elle veut participer à des dons de sang. Également,
cela permet de déceler certains troubles s’il y a lieu. Par contre, les prises de sang ne
sont pas recommandées lorsque la personne souffre d’anémie.

Réalisation et interprétation d'un groupage ABO

Le groupage sanguin ABO est la seule recherche des antigènes à la surface des
globules rouges qui comporte deux épreuves : l'épreuve globulaire (Beth-Vincent)
et l'épreuve plasmatique (Simonin-Michon). Ce groupage comporte cette spécificité
du fait que chaque individu d'un groupe comporte les anticorps dirigés contre les
antigènes du système ABO.

A la naissance, le groupe ABO est défini génétiquement dans le noyau de

l'érythroblaste (précurseur du globule rouge), il n'existe pas d'anticorps dirigés
contre les autres antigènes du système ABO. Cette immunisation se réalise au cours
des 3 premiers mois de la vie, lorsque le corps du nouveau-né est exposé aux
différents germes de l'environnement. Cette exposition conduit à la création
d'anticorps notamment les anticorps des groupes sanguins, le système ABO n'étant
pas exclusivement d'origine érythrocytaire. Ces anticorps sont dits "naturels".

Epreuve globulaire (Beth-Vincent) :

Cette épreuve consiste à mettre en évidence les antigènes du systeme ABO à la

surface des globules rouges du patient à l'aide d'anticorps (antisérum) spécifiques
afin de déterminer le groupe ABO du patient. Lors de cette épreuve, il doit être
utilisé un anti-A, un anti-B et un anti-A,B (l'anti-B ne doit pas reconnaitre le B
acquis, l'anti-A ou/et l'anti-AB doivent reconnaitre les Ax). L'anti-A permettra de
reconnaitre les individus possédant les antigènes A; l'anti-B les individus possédant
l'antigène B et l'anti-A,B les individus possédant l'antigène A et/ou l'antigène B.

Epreuve plasmatique (Simonin-Michon) :

Cette épreuve consiste à mettre en évidence les anticorps du système ABO

contenus dans le plasma du patient à l'aide de globules rouges de groupe ABO
connu. Lors de cette épreuve, il est utilisé des globules rouges de groupe A1 et des
globules rouges B (hors difficulté de groupe). Un individu de groupe A possède les
anti-B, le plasma conduira à une agglutination avec les globules rouges de groupe B
ou de groupe AB. Un individu de groupe B possède des anti-A et des anti-A1, le
plasma conduira à une agglutination avec les hématies de groupe A. Les individus
O possèdent des anti-A, des anti-B, des anti-A,B et des anti-A1, le plasma conduira
à une agglutination avec les hématies A, B et AB, alors que les individus de groupe
AB ne possèdent pas d'anticorps, il n'y aura donc aucune réaction avec les
différentes hématies.

Épreuves globulaire et sérique pour chaque groupe sanguin

Il est important de centrifuger en parallèle l’épreuve globulaire et l’épreuve sérique de

chaque sujet, d’inscrire immédiatement les résultats et de vérifier la concordance entre
l’épreuve globulaire et l’épreuve sérique. L’agglutination des globules rouges en présence
d’un antisérum indique la présence de l’antigène correspondant sur les globules rouges et le
résultat du test est alors positif. Une absence d’agglutination indique l’absence de l’antigène
correspondant et le résultat du test est alors négatif. Le tableau ci-contre indique les résultats
obtenus à l’épreuve globulaire et à l’épreuve sérique pour chacun des groupes sanguins. Ce
même principe est applicable pour l’épreuve sérique. Dans ce cas, une agglutination indique
la présence de l’anticorps dans le sérum du sujet à tester et une absence d’agglutination
indique l’absence de l’anticorps dans le sérum du sujet à tester. Une discordance entre
l’épreuve globulaire et l’épreuve sérique doit être obligatoirement expliquée avant de
confirmer le groupe sanguin. Si le malade doit recevoir du sang, on doit transfuser des culots
globulaires O jusqu’à ce que la démarche soit complétée.

Coloration MGG :
a coloration de May-Grünwald Giemsa, parfois également appelée coloration
de Pappenheim est une méthode de coloration utilisée notamment en hématologie pour
différencier les cellules du sang lors des préparations cellulaires (cytologie). Les colorations de
May-Grünwald, Giemsa, Leishmann sont des variétés de la méthode de Romanowsky (médecin
russe, 1861-1921).

Technique
Le mode opératoire ci-dessous est donné à titre indicatif. Il doit être adapté selon les
spécifications du fabricant.

Fixation
Il faut d'abord fixer les cellules sanguines présentes sur le frottis. Pour cela placer le frottis
horizontalement dans une boîte de coloration et verser 15 à 20 gouttes de colorant May-
Grünwald de façon à recouvrir totalement la lame. Attendre 2 à 3 minutes pour que
le méthanol fixe les cellules.

Coloration May-Grünwald
Ajouter autant d'eau neutre qu'il y a eu de colorant, laisser agir deux minutes et rincer la lame à
l'eau neutre.

Coloration au Giemsa
Diluer le Giemsa immédiatement avant l'utilisation en mettant 20 ml d'eau neutre avec 30 gouttes
de colorant dans une éprouvette. Verser le contenu dans une boîte de Laveran dès que la lame
est prête et mélanger en agitant doucement (le pouvoir du colorant est maximal au moment du
mélange). Poser la lame, face frottis vers le fond de la boîte de Laveran. Laisser agir 20 min. et
rincer à l'eau neutre.

Séchage
Laisser la lame sécher à l'air. Attendre le séchage complet avant observation au microscope.

Observation :

2.5numération de la formule sanguine

2.6 Hémostase
L'hémostase est l'ensemble des phénomènes du sang et des vaisseaux sanguins prévenant ou
permettant l'arrêt de l'écoulement du sang et ainsi, contrôlant physiologiquement le retour à une
circulation normale. Une séquence d'activation physiologique et moléculaire s'enclenche pour
éviter le saignement en cas de brèche vasculaire. Celle-ci aboutit à la formation d'un caillot
sanguin sur son site actif (la brèche vasculaire), grâce à des processus de régulation.
L'hémostase peut être décrite schématiquement en plusieurs étapes :

1. Le temps de réaction vasculaire (concerne la contraction de l'endothélium) ;

2. Le temps plaquettaire (premier élément interne au sang réagissant : les plaquettes) ;
3. Le temps de coagulation (activation de facteurs de coagulation menant à la formation
d'un caillot) ;
 4. La fibrinolyse (post-coagulation avec destruction du réseau de fibrine et donc du caillot).
Le processus d'hémostase peut dysfonctionner sous de nombreux aspects et de par ce fait
amener au développement de nombreuses pathologies. La connaissance de ce processus
permet d'adapter les soins aux individus souffrant de problèmes hémostatiques et leurs
caractéristiques.
De nombreux médicaments permettent de contrôler le processus d'hémostase et ainsi d'éviter la
formation de caillots sanguins ou la survenue d'hémorragie. Certains, utilisés depuis de
nombreuses années, sont susceptibles d'avoir un effet contraire à celui escompté, comme
l'héparine qui provoque des troubles TIH. De nouvelles solutions médicamenteuses sont
proposées.
En dehors de ce champ de prophylaxie, il existe aussi des soins regroupés sous le terme
hémostase médicale, ne passant pas par une prise de médicament mais qui mettent en œuvre
des techniques physiques d'arrêt de l'hémorragie.

Balance hémostatique

Hémostase : équilibre entre le déclenchement du processus de coagulation et la neutralisation de celui-ci

par la fibrinolyse, selon les acteurs intervenants et leur concentration.
La cascade de coagulation, troisième étape de l'hémostase, entraîne la formation d'un caillot
sanguin par l'apparition de facteurs pro-coagulants. Des mécanismes de régulation se
déclenchent ensuite, permettant d'éviter que l'état thrombotique (formation de thrombus, ou
caillots sanguins) ne se généralise à toute la circulation (apparition de facteurs anticoagulants).
En fin de processus thrombotique, le caillot sanguin est dissous dans le processus
de fibrinolyse par l'activation de facteurs spécifiques apparaissant dès le début de la thrombose.
L'apparition de l'état de thrombose ou de circulation fluide du sang dépend donc de la
concentration de ces différents facteurs à chaque étape de l'hémostase 1.
Cet équilibre peut être représenté sous forme de balance hémostatique, observable, entre
autres, dans la cascade de coagulation. Certains facteurs permettant la formation du caillot
sanguin génèrent aussi les facteurs de neutralisation de la coagulation2. Ainsi, la thrombine,
facteur de coagulation, transforme le fibrinogène en fibrine et permet la formation du thrombus,
mais elle permet aussi l'activation d'autres facteurs de la coagulation et génère sa propre
activation et entraîne donc la balance dans le sens de la coagulation. La thrombine active en
parallèle la thrombomoduline ce qui conduit à l'arrêt du processus de coagulation, par
l'intermédiaire de la protéine C et de la protéine S. La concentration des différents acteurs
détermine lequel des processus sera privilégié.

Physiologie
Lorsqu'un vaisseau sanguin est blessé, diverses étapes se mettent en place.
 La vasoconstriction3 est une réponse immédiate à la lésion d'un vaisseau. Elle se traduit par
la contraction du vaisseau sanguin; le spasme vasculaire diminue le diamètre du vaisseau et
ralentit le saignement. La vasoconstriction dure 15 à 60 secondes et a pour effet de ralentir la
circulation sanguine au niveau du vaisseau déchiré et de faciliter le déroulement des
réactions suivantes et d'accroître leur efficacité.
 L'hémostase primaire se produit de la manière suivante; les plaquettes se lient
au collagène se trouvant sur les parois vasculaires. Elles sont exposées de manière à former
un amas, le clou plaquettaire de Hayem (Georges Hayem) : l'agrégation
plaquettaire provoque l'adhésion des plaquettes entre-elles.
 L'hémostase secondaire ou coagulation succède à ces étapes préliminaires. Tout d'abord, la
phase préparatoire de la coagulation est déclenchée par le contact d'une protéine
plasmatique, le facteur XII ou facteur Hageman4 avec les tissus. La coagulation implique une
cascade complexe de facteurs de coagulation, ce qui aboutit à la transformation
du fibrinogène, une protéine du sang, en fibrine polymérisée, ce qui crée un caillot. Ce
processus dure 3 à 6 minutes après rupture du vaisseau. Compris au départ par son
processus in-vitro et séparé en voie extrinsèque intrinsèque et commune, la coagulation
sanguine a vu son modèle changé au cours du temps. On l'explique actuellement par 4
phases : Initiation, amplification, propagation stabilisation.
 Le caillot attire et stimule la croissance de fibroblastes et de cellules de muscle lisse au sein
de la paroi vasculaire, et entame le processus de réparation qui résultera finalement en la
dissolution du caillot (fibrinolyse).
 La fibrinolyse ou la dissolution du caillot sanguin passe par la dégradation de la fibrine en
PDF (produit de dégradation de la fibrine) et fragment FPa et FPb. Cette réaction est
catalysée par la plasmine qui peut être régulée positivement ou négativement. Ainsi, le tPA
(tissu Plasminogen Activator) active la plasminogène en plasmine, l'urokinase également
mais dans une moindre mesure, alors que le PAI inhibe le tPA et l'α2-antiplasmine neutralise
la plasmine5.

Troubles de l'hémostase
L'hémostase, comme fonction physiologique, mène à la thrombose puis se poursuit jusqu'à la
dissolution du caillot sanguin. Les causes de la thrombose ont été décrites en premier par Rudolf
Virchow6 en 1858, qui propose le terme de triade de Virchow pour expliquer les trois facteurs
menant à la thrombose :

1. La lésion endothéliale (coupure intérieure d'un vaisseau sanguin) ;

2. L'anomalie du flux sanguin ;
3. L'état d'hypercoagulabilité.
Les troubles de l'hémostase peuvent toucher différentes phases de l'hémostase. La phase
primaire correspondant aux premières actions physiologiques avant l'activation des facteurs en
cascade. La phase secondaire correspondant à l'activation en cascade amenant à la formation
du réseau de fibrine emprisonnant les globules rouges. Cet amas forme le thrombus et permet
d'arrêter le saignement, le temps de la cicatrisation.
Le thrombus rouge ne peut pas se former complètement en raison d'un flux sanguin trop
important, selon que la circulation est artérielle ou veineuse.

Hémostase et circulation sanguine]

La finalité de la coagulation dans son aboutissement total est la formation d'un caillot sanguin
appelé thrombus rouge. Les événements hémostatiques peuvent ne pas se dérouler jusqu'à
cette étape finale qui nécessite des conditions physiologiques optimales. La pression sanguine
trop importante, dans les artères (vaisseaux dont le flux sanguin sort du cœur), par exemple,
raccourcit le processus. Dans ce cas, l'hémostase est principalement activé jusqu'à la phase
plaquettaire et forme le thrombus blanc. Le thrombus rouge doit son nom à sa couleur, due à
l'emprisonnement des globules rouges par le réseau de fibrine. Le thrombus blanc, quant à lui,
est essentiellement formé de plaquettes agrégées. Le thrombus rouge se situe au niveau des
veines et le blanc au niveau des artères, lorsqu'il y a thrombose. En effet, dans les veines le flux
sanguin est plus lent et toutes les étapes de l'hémostase peuvent se dérouler. De la circulation
sanguine dépendent donc les troubles hémostatiques.

Troubles de l'hémostase primaire]

 Thrombocytopénie7 (purpura thrombopénique idiopathique) : observable par une chute des

plaquettes, appelées aussi thrombocytes. La coagulation intravasculaire disséminée (CIVD)
également peut se manifester par un abaissement du niveau plaquettaire.
 Maladie de von Willebrand8 (vWF) : ce facteur globule blanc, lors d'une brèche, permet de
stimuler les plaquettes.
Troubles de l'hémostase secondaire
Maladies hémorragiques]

 Hémophilies9.
 Déficit en vitamine K10.
 Insuffisance hépato-cellulaire (dysfonctionnement des cellules du foie).
Maladies pro-coagulantes]

 Phlébites11, problème circulatoire au niveau des jambes dû à la formation d'un caillot laissant
passer le sang partiellement ou bloquant la circulation.
 TV (thrombose veineuse).
 TVP (thrombose veineuse profonde).
 CIVD (coagulation intravasculaire disséminée)12.
 Embolies systémiques.
Ces maladies doivent être traitées car elles peuvent mener à des embolies pulmonaires ou des
AVC (accidents vasculaires cérébraux).

Pathologie des inhibiteurs de la coagulation]

Les inhibiteurs de la coagulation sont des facteurs anticoagulants permettant l'arrêt du processus
de coagulation, prémisse au retour de la circulation sanguine normale. Comme la Protéine C, la
Protéine S, l'Antithrombine, la Thrombomoduline, ces molécules agissent comme inhibiteurs et
font pencher la balance vers le retour à la circulation sanguine normale. À l'inverse, si ces
facteurs sont défectueux l'état procoagulatoire ne peut s'arrêter, ce qui peut amener à des
thromboses13.

Thérapie]
Maladies hémorragiques et traitements]
La maladie hémorragique la plus connue est l'hémophilie. Il s'agit de déficits congénitaux,
génétiques ou acquis de certains facteurs de coagulation14. L'hémophilie concerne avant tout
le facteur VIII:c et facteur IX mais peut concerner aussi le facteur XI15. Le déficit du facteur VIII:c
est appelé « hémophilie A » et celui de facteur IX « hémophilie B ». Quant au déficit de facteur
XI, il peut être nommé « hémophilie C »16. L'hémophilie survient soit à la suite de troubles
génétiques, soit elle provient d'auto-anticorps neutralisant les facteurs présents. Si ces anticorps
sont présents dès la naissance les troubles sont dits congénitaux. L'hémophilie peut aussi être
acquise lors d'une défaillance du système immunitaire ce qui déclenche une maladie auto-
immune17. Les auto-anticorps sont souvent dirigés contre le facteur VIII:c.
La posologie médicamenteuse peut être une supplémentation des facteurs activés défaillant,
comme le facteur VIII:c ou facteur IX, ou de facteur XI dans le cas de l'hémophilie héréditaire ou
congénitale. Ces facteurs peuvent être extraits d'un pool de plasma par
méthode chromatographique ou synthétisé par recombinaison génétique18. La recombinaison
génétique permet également de modifier certains de ces facteurs, pour les rendre plus résistants
(allongement de la durée de demi-vie) et ainsi plus performants dans le traitement des
hémophiles, comme par l'ajout d'un groupement PEG (polyéthylène glycol) à la structure d'un
facteur. Dans le cas de présence d'auto-anticorps anti-FVIII, la neutralisation de ces anticorps
peut être envisagée.
L'hémorragie peut, également, survenir à la suite d'un traitement anticoagulant, chez des patients
auxquels une dose non adaptée a été administrée. Le chirurgien, dans ce cas, envisage un
traitement mais qui est limité par les outils qu'il a à sa disposition. Ainsi, s'il existe un inhibiteur de
l'anticoagulant injectable, une dose peut être injectée au patient. S'il n'en existe pas, le clinicien
doit chercher à limiter le saignement par ajout de facteurs anticoagulants spécifiques. Le patient
peut, aussi, être dialysé ; procédé qui permet de filtrer le sang à travers une membrane artificielle
et d'extraire l'anticoagulant. Le sang épuré est réinjecté avec un dialysat artificiel contant de l'eau
pure et des sels minéraux de composition comparable à celle du sang.
Dans le cas de traitements à base d'Anti-vitamines K, le traitement en cas d'hémorragie
médicamenteuse consiste à supplémenter le sang en facteurs de coagulation actifs. Si le
traitement est un anticoagulant anti-IIa ou anti-Xa, les facteurs spécifiques FIIa dans le premier
cas et FXa dans le deuxième peuvent être injectés au patient.
L’idarucizumab est un antidote neutralisant le dabigatran qui est anticoagulant, agissant sur la
thrombine. Cet antidote est un fragment d'anticorps neutralisant directement le dabigatran. Les
anti-FXa peuvent être neutralisés par l’andexanet alfa19, qui est une molécule recombinante. Ces
anti-FXa sont l'enoxaparine et le fondaparinux, analogues de l'héparine mais aussi des
anticoagulants directs (rivaroxaban, apixaban, edoxaban).

BTraitement des maladies pro-coagulantes[]

L'utilisation des médicaments anticoagulants permettent de neutraliser l'état d'hypercoagulabilité.
Des médicaments ont été développés au cours du temps.

 Les antivitamines K20 ou AVK permettent de neutraliser la vitamine K qui a un rôle dans la
maturation des facteurs de la coagulation. L'absence de vitamine K rend les facteurs de la
coagulations inactivables.
 Les inhibiteurs de la thrombine injectables21 (Lépirudine, Désirudine, Bivalirudine).
 L'inhibiteur de la thrombine à prise oral (Dabigatran).
 Les inhibiteurs du facteur Xa22 (héparines non fractionnés et de bas poids
moléculaire, Argatroban, Arixtra), FXa inibé par l'intermédiaire du facteur régulateur de la
coagulation, l'antithrombine.
 Les inhibiteurs du facteur Xa direct et à prise
oral (Apixaban, Rivaroxaban, Edoxaban, Bétrixaban). Certains médicaments en s'éliminant
produisent des métabolites pouvant également avoir un effet anticoagulant comme c'est les
cas pour l'Edoxaban23.
 La chirurgie permet d'éliminer les caillots bouchant un vaisseau sanguin, s'accompagne
d'un traitement anticoagulant24.
Les anticoagulants injectables
Utilisation à l'origine
En cas de chirurgie, les médicaments anticoagulants utilisés sont injectables
comme l'héparine ou l'hirudine. Ces médicaments ont été utilisés avec succès pendant de
nombreuses années et restent utilisables en chirurgie, principalement l'héparine. L'Hirudine est
de moins en moins utiliser dû à des saignements difficilement contrôlables. Il existe également
certaines personnes qui peuvent développer une allergie à l'héparine, même si ce cas reste très
rare. Des solutions ont été trouvées pour répondre à ces problèmes par l'utilisation de palliatifs
thérapeutiques, cela est développé ci-après.
Effets secondaires
Il existe cependant des cas où ces médicaments donnent des complications. L'héparine
(anticoagulant anti FXa) peut entraîner l'apparition d'une TIH (Thrombopénie induite par
l'héparine)25.
La TIH est identifiée par une chute des thrombocytes ou plaquettes est en fait une réaction
allergique du patient ; le patient développe des anticorps contre les plaquettes modifiées par
l'héparine, ce qui entraîne une activation de la coagulation. L'héparine développe un rôle inverse
que sa réelle utilisation thérapeutique et fait donc courir un risque mortel au patient. Il est
possible dans ce cas, d'utiliser des héparines fractionnés26, créant moins de réactions allergiques
ou d'autres anti-coagulants basés sur la neutralisation du FIIa comme l'hirudine, utilisable en
injection. L'hirudine, un anti-thrombine se lie sur la thrombine (FIIa) de manière irréversible, ce
qui entraîne pour le patient des risques hémorragiques. Cette molécule peut être remplacée par
l'argatroban27 ou la bivalirudine28 qui sont actifs, également, sur la thrombine mais s'y liant de
manière réversible. La bivalirudine est utilisée, dans le cas de chirurgie cardiopulmonaire et lors
de mise en place d'un contournement de la circulation sanguine29 (circulation extra-vasculaire).
Outre, les pathologies TIHs les héparines peuvent provoquer des hémorragies , lors d'un
surdosage. Ces saignements sont particulièrement présents chez les patients traités à l'hirudine
selon de nombreuses publications30. L'hirudine réagit sur le thrombine de façon irréversible, ce
qui demande un ajustement posologique précis.
Les médicaments à prise orales Antivitamine K et AODs (anticoagulants oraux direct)
Depuis 10 à 15 ans sont apparus une nouvelle sorte d'anticoagulants. Ils sont spécifiques de
certains facteurs de la coagulation comme le facteur IIa (Thrombine) ou le Facteur Xa. Comme
les AVKs, ils sont préhensibles par voie orale mais ne présentent pas les mêmes contraintes
alimentaires31.
Les AVKs, en effet, agissent directement sur la synthèse des protéines en les empêchant d'entrer
à maturation. Ces facteurs n'étant plus mature ne peuvent plus être activés dans la cascade de
coagulation. Il s'agit des facteurs (FII, FVII, FIX et FX) ainsi que des inhibiteurs de la coagulation
(protéines C et S).
Les anticoagulants peuvent être spécifiques du Facteur Xa (Apixaban, Rivaroxaban, Edoxaban)
ou de la thrombine (FIIa) (Dabigatran) Ces anticoagulants sont utilisés en relais après une
opération chirurgicale mais doivent être dosés chez certains patients. Il s'agit de patients aux
caractéristiques extrême, très faible poids ou très élevé, âge important ou patients ayant des
antécédents thrombotiques.
Il existe des tests spécifiques de laboratoire pour chacun de ces anticoagulants.

Le problème des TIH

Pour tout traitement à base d'héparine, le chirurgien doit s'assurer que le patient ne développe
pas une thrombopénie induite par l'héparine (TIH) par suite du traitement injecté. L'héparine,
anticoagulant injectable communément utilisé pour traiter les patients en cas de chirurgie, peut
déclencher avec le temps une pathologie particulière. Cette pathologie est observable par la
chute des thrombocytes, appelés aussi plaquettes. Il peut y avoir aussi chez le patient
l'observation de coagulation intravasculaire disséminée (CIVD).
Il s'agit d'une action inverse de l'héparine qui, au lieu de jouer son rôle d'anticoagulants,
provoque indirectement des agrégations plaquettaires et l'activation par endroit de la coagulation.
Cela met le patient susceptible de développer des thromboses en grave danger et nécessite de
trouver au plus vite un traitement palliatif car le risque de décès est très important.
Il a été démontré que les TIH pouvaient être engendrées par des auto-anticorps spécifiques des
plaquettes, plus précisément du fragment PF4. Il s'agirait d'une modification de la surface
plaquettaire provoquée par l'héparine. Une solution a été trouvée : traiter les patients avec des
héparines composés de chaînes moléculaires moins longue, donc de bas poids moléculaire.
Mais il reste des cas de patients développant des TIH32 avec ces molécules modifiées.
Traitements palliatifs
Lorsque les TIH ont été identifiés les chirurgiens utilisèrent l'autre anticoagulant historiquement
connu, l'hirudine, spécifique de la thrombine mais non réversible. L'hirudinea provoqué de
nombreux accidents dus à des saignement. La recherche de nouvelles molécules a dû être
envisagé.
Des dérivés de l'héparine sont apparus comme l'argatroban ou l'enoxaparine qui sont des
molécules modifiées proche de l'Héparine.
D'autres molécules anticoagulantes depuis quelques années synthétisées par l'industrie
pharmaceutique et pouvant être pris oralement commencent à s'imposer comme traitements
palliatifs33.
Ils présentent l'avantage de permettre à des patients ayant tendance à avoir des thromboses
récidivantes de pouvoir suivre un traitement à la maison. Ces médicaments peuvent être anti-FIIa
ou anti FXa. Ils sont appelés AODs (anticoagulants oraux directs) :

1. AntiI-FIIa : Dabigatran ;
2. Anti-FXa : Apixaban, Rivaroxaban, Edoxaban34, Betrixaban35.

Tests hémostatiques
Tests en salle opératoire de l'hémostase
Le test ACT36 (activated clotting times) peut se réaliser directement en salle opératoire et
s'effectue sur du sang total. Il évalue le temps de coagulation global avec un activateur
particulier. Cela donne une idée générale de la réaction de coagulation permettant de détecter
les premiers troubles. Ce test est principalement utilisé en cas de chirurgie cardiaque 37.

Tests de laboratoire de l'hémostase

La coagulation peut aussi être testée en laboratoire biologique :
En laboratoire, il existe plusieurs tests permettant d'évaluer la coagulation: les tests moléculaires
de numération plaquettaire et aussi des tests spécifiques de la qualité des facteurs de la
coagulation de la voie extrinsèque (temps de prothrombine) ou de la voie intrinsèque (temps de
céphaline activé). Ces deux derniers tests nécessitent l'utilisation d'un des composants du sang
des patients, le plasma sanguin38.
Le plasma du sang est obtenu par centrifugation sous anticoagulant, Citrate de sodium, EDTA
(Éthylènediaminetétraacétique) ou héparine. Selon l'anticoagulant utilisé, pour recueillir le sang le
test réalisé est différent.
Tests à partir de plasma recueillis sous EDTA[
L'EDTA chélate les ions calcium, essentiels dans la réaction de coagulation. Le sang recueilli
avec cet anticoagulant est utilisé pour observer les éléments figurés du sang ; numération des
cellules sanguines, les globules rouges ou les globules blancs, les plaquettes (premiers éléments
du sang intervenant dans l'hémostase).
Tests à partir de plasmas recueillis sous citrate de sodium ]

 Il est possible d'obtenir par centrifugation douce à partir d'un sang recueilli sur tube de citrate
de sodium un plasma riche en plaquette PRP. Une centrifugation plus intense constitue le
PPP (plasma pauvre en plaquettes). Ces différents qualité de plasmas permettent de réaliser
des tests spécifiques d'agrégation plaquettaire, pour un patient donné.

 Pour l'évaluer les tests de thrombose, le plasma est essentiellement recueilli sur des tubes
de citrate de sodium.
Tests de coagulation
Le temps de prothrombine ou test TP explore l'efficacité des Facteurs VII, II ou prothrombine,
Facteur X Facteur V. Sa mesure permet de suivre le traitement des patients sous anticoagulants
AVK, par mesure de l'INR (en utilisant le temps de prothrombine et détermination du taux de
prothrombine39).
Le TCA anormal donc allongé permet de conclure à un déficit qualitatif ou quantitatif du facteur
VIII Facteur IX, Facteur XI ou XII et du facteur Willerbrand.
Ces tests peuvent en outre être complétés par des analyses de certains facteurs unitaires, le
facteur X seul, le facteur VII seul, le facteur VII activé, le facteur VII+X, le facteur IX, le facteur
VIII:c, etc. Ils peuvent être testés en concentration par des tests chromogènes ou par leur
capacité anticoagulante par des tests coagulométriques.
Il est possible aussi de tester spécifiquement les facteurs activés.
Enfin, de plus en plus, des tests sont proposés pour le dosage d'anticoagulants par réaction
chromogène ou par mesure du retardement du temps de coagulation.
Ainsi, les AODs ne nécessitent en général pas de dosage. Cependant dans certains cas les
doser dans le sang des patients s'est avéré utile. En effet, certains patients avec des risques
thrombotiques particuliers nécessitent un suivi.
Cela est le cas des patients ayant des risques de thromboses élevés après une opération, pour
des patients ayant un poids extrême très faible en dessous de 50 kg ou très élevés supérieur à
120 kg, des patients avec risque de saignement. Certains AODs sont éliminés par le rein, les
patients avec une déficience rénale doivent avoir une surveillance particulière. Pour tous ces cas,
des dosages sont disponibles.
Spécialement, les AODs anti-Xa étaient prévus au début en chirurgie orthopédique. Pour éviter
toute complication et risque de thrombose post opératoire, doser le médicament s'est avéré
parfois nécessaire40.
Tests de Fibrinolyse
Les tests de fibrinolyses concernent essentiellement le facteur de la coagulation responsable du
maillage de Fibrine. Avant son activation en Fibrine, le Fibrinogène est constitutif du sang, lors de
la phase de coagulation il est clivé en Fibrine et sa concentration générale dans le sang diminue,
évaluer sa concentration permet de mettre en évidence un état thrombotique si celle-ci est
diminuée par rapport à des normes définies. Cependant, faire un test de concentration de
Fibrinogène41 n'est pas suffisant car un abaissement de son taux pourrait venir de toute autre
cause dont la présence d'anticorps anti-Fibrinogène. Le tests D-Dimère42 est plus spécifique de la
Fibrinolyse car il mesure la présence de produits de dégradations, il indique la présence de
Thrombus en état de Lyse.
Tests spécifiques des anticoagulants]
Dosage des anticoagulants injectable
Avec le temps des tests de plus en plus spécifiques des anticoagulants ont été créés par les
industriels. Il existe ainsi des tests spécifiques das anticoagulants injectables basés sur la
neutralisation du facteur que l'anticoagulant cible. Ainsi, l'héparine peut être dosé en retour, grâce
à un réactif chromogène réagissant soit avec le FIIa soit avec le FXa 43. De la même manière, ce
type de test peut être développé pour l'hirudine avec le dosage en retour du FIIa. Il existe aussi
des méthodes coagulantes mesurant l'allongement du temps de coagulation en fonction de la
concentration d'anticoagulant. Un tel test a été développé pour l'hirudine ou d'autres anti-IIa 44.
L'héparine neutralise le FXa et le FIIa par le biais de l'Antithrombine à qui elle confère une activité
500 à 1 000 fois supérieure dans l'inhibition de ces deux molécules. Des études ont montré que
les tests chromogènes basés sur le dosage en retour du FXa sont plus efficaces, ils sont
généralement privilégiés pour doser l'héparine45.
Dosage des anticoagulants directs à prise orale
Le développement des tests sur les marchés d'anticoagulants spécifiques, d'un ou deux facteurs
de la coagulation, a pu être étendu aux anticoagulants AODs, introduits plus tard en utilisation
clinique. Les tests des héparines peuvent être utilisés pour doser les AODs anti-Xa et ceux de
l'hirudine le dabigatran, AOD anti-IIa46.
Des tests innovants permettent dans le cas de relais vers un anticoagulant à prise oral après une
opération sous héparine de doser, soit spécifiquement l'AOD, soit l'activité anticoagulante globale
pouvant être provoqué à la fois par le résiduel d'héparine qui s'ajoute au traitement oral 47. Ce type
de test permet au médecin d'ajuster au mieux le traitement pour son patient en vérifiant
l'élimination de l'héparine ou de l'AOD au cours du temps.

Hémostase médicale
L'hémostase est étudiée depuis plus de cent-cinquante ans. Elle a été théorisée par Virshow en
1958 dans les pathologies liés à son dysfonctionnement (voir troubles de l'hémostase).
L'observation de coupes de tissus a permis au début du XXe d'avoir une première approche du
processus physiologique hémostatique et de la nature des acteurs biologiques intervenants 48.
L'acte médical consistant d'empêcher les saignements issus d'une plaie ou provenant d'un acte
chirurgical est aussi appelé hémostase. Cet acte nécessite un matériel spécifiquement dédié.
Cela peut être une pince (clamp) posée sur un vaisseau pour en interrompre le flux sanguin
(« clampage »).
Pour les vaisseaux fins ou lorsque les parois doivent être préservés, les mors de la pince peuvent
être protégés par des embouts plastiques (certaines pinces sont directement conçues pour être
atraumatiques) ou utiliser des lacs chirurgicaux qui sont de petits élastiques en silicone souple,
passés de part et d'autre, du vaisseau et tirés par une pince pour les couder. Les lacs
chirurgicaux permettent la rétraction, l’occlusion des artères et veines sans traumatismes.
L'hémostase peut être faite de manière définitive en pratiquant la ligature d'un vaisseau qui
consiste à réaliser un nœud avec un fil chirurgical sur le vaisseau ou en appliquant un clip
métallique. En neurochirurgie, pour arrêter le saignement de la tranche de section de l'os du
crâne et en chirurgie cardiaque pour arrêter le saignement de la tranche de section sternale, on
applique de la cire de Horsley. Dans la plupart des chirurgies, l'hémostase est réalisée en brûlant
au bistouri électrique ou à la pince bipolaire le vaisseau qui saigne, ceci notamment pour les
vaisseaux du tissu sous-cutané.
Par des procédés radiologiques, on peut aussi boucher un vaisseau sanguin depuis l'intérieur du
vaisseau par embolisation. Le traitement des anévrismes intracrâniens fait appel à
des coils (petits ressorts en platine) qui évitent la déformation du vaisseau.
À ces mesures chirurgicales s'ajoutent des mesures de réanimation quand l'hémostase
physiologique du patient devient pathologique (diminution des facteurs de coagulation, des
plaquettes) via des transfusions de produits dérivés du sang ayant pour but de relever la
coagulation49.
On peut à juste titre concéder à Eugène Koeberlé50 la paternité de ces techniques puisqu'il a, dès
1862, perfectionné une panoplie d'instruments dont sa fameuse pince hémostatique à cliquet.
Intervenir sur l'hémostase, c'est également traiter les cas d'hypercoagulabilité par des traitements
spécifiques

3 Bactériologie
3.1 Hémoculture
L’hémoculture consiste à mettre en culture du sang circulant qui est normalement
stérile, afin de pouvoir rapidement détecter et identifier l’agent infectieux responsable
d’une bactériémie. L’échantillon de sang doit être prélevé aseptiquement et en
quantité suffisante, le délai de culture est souvent long.
L’hémoculture est un examen important en bactériologie médicale, il permet de
mettre en évidence le passage de micro-organismes dans le sang, de les identifier et
enfin de déterminer leurs profils de sensibilité aux ATB. De très nombreux agents
pathogènes peuvent être isolés à partir d’hémoculture, à savoir des bactéries et des
champignons. Pendant longtemps, les techniques manuelles étaient le seul outil
diagnostique jusqu’à l’arrivée des automates révolutionnant la phase analytique.

1- Bactériémie:
est la présence éphémère de bactéries dans la circulation sanguine, les décharges
bactériennes se font soit via le syst lymphatique, soit directement dans le sang de façon
passagère ou durable, s’accompagnant ou pas de symptômes cliniques. Le tableau
clinique consiste svt en un syndrome de réponse inflammatoire systémique (SRIS)
associant 2 des signes suivants: fièvre, hypotension, tachycardie, tachypnée, leucopénie
ou hyperleucocytose.

Actuellement, on définit 3 types de bactériémies:

- Transitoire:
Décharges brèves de bactéries dans le sang, sans manifestations cliniques et
spontanément résolutives;
- Continue: décharges continuelles qui se rencontrent notamment lors d’endocardites ou
en cas de brucellose ou de fièvres typhoïde;
- Intermittente: décharges bactériennes répétées à la suite d’infections diverses.
2- Septicémie:
Appelée aussi sepsis, désigne une infection grave de l’organisme caractérisée par la
présence de germes pathogènes dans le sang, les voies lymphatiques et les organes. Il
existe différents types de septicémies:
• Septicémie d’origine thromboembolique: porte d’entrée muqueuse ou tégumentaire;
• Septicémie d’origine lymphatique: porte d’entrée svt digestive;
• Septicémie par effraction: (milieu extra hospitalier: interventions dentaires sanglantes;
milieu hospitalier: chirurgie digestive, endoscopie,…)
 Etiologies microbiennes
Groupes Rôle Agents
microbiens
Groupe I: Agents Indiscutable: -Salmonella typhi-
pathogènes spécifiques Salmonella paratyphi A, B,
1flacon (+) suffit pour poser C-Brucella spp-Haemophilus
de diagnostic influenzae -Neisseria
menigitidis-
Campylobacterjejuni-
Streptococcus pneumoniae-
Streptococcus BH gpe A, B-
Clostridium perfringens-
Bacteroides fragilis

Groupe II: Agents Discuté en -Entérobactéries:E.coli, KES,

pathogènes fonction: Proteus, Salmonelles
mineures
opportunistes
-nombre de flacons (+) -Pseudomonas aeruginosa
-porte (s) d’entrée -Staphylococcus aureus/
SCN
-terrain
-Streptocoque gpe D et NG
-Levures: Candida albicans

Groupe III: Agents Très discuté: -Acinetobacterbaumanii

commensaux ou -Stenotrophomonas
-flores normales et
saprophytes maltophilia
environnement
-Corynebacterium spp
-contaminants fréquents
-Bacillus spp
-Propionibacterium acnes
-Contexte et objectifs
Toute fièvre d’origine indéterminée, surtout si elle est accompagnée de signes
cliniques évocateurs d’infection, doit faire pratiquer des hémocultures. Selon le
contexte clinique, les objectifs sont les suivants:-Diagnostic étiologique de la
bactériémie-Recherche du foyer originel (porte d’entrée) -Choix de l’antibiothérapie -
Suivi et surveillance de l’efficacité du traitement antibiotique.
-Prélèvement
En milieu hospitalier, les hémocultures représentent les prélèvements les plus
fréquemment prescrits. Mode de prélèvement: doit être réalisé après antisepsie
rigoureuse, pour éviter toute contamination par des germes cutanés ou ambiants.
Technique: Préleveur: -lavage des mains-port de gantsPatient: -asepsie de la peau
au point de ponction de façon centrifuge (nettoyage à l’alcool éthylique à 70°, ATS
avec produit iodé telle la polyvidone iodée) ou (2 fois alcool à 70°)
Il faut désinfecter l’opercule du flacon avec alcool 70°ou polyvidone iodée.Le
système de prélèvement est une tubulure munie de 2 aiguilles, l’une servant à
pratiquer la ponction veineuse et l’autre à inoculer le flacon grâce à un adaptateur.
Site du prélèvement:
-Site habituel: ponction veineuse au niveau de la veine du pli du coude
-Veine jugulaire, KT ombilical ou talon (dispositif de microhémoculture): N né,
prématuré
-KT intra artériel ou intra veineux: prélèvement à proscrire

Moment du prélèvement: Quand prélever?

 Objectif du choix du moment: éviter tout faux négatif Prélever le plus tôt
possible au cours de la maladie
 En dehors de toute antibiothérapie ou sous fenêtre thérapeutique de 48 -72H.
 Bactériémie continue: peu importe le moment
 Bactériémie discontinue: pic thermique, hypothermie, frissons ou sueurs

Nombre de flacons : 1 hémoculture = 2 flacons (anaérobie/aérobie)

Bactériémie continue: 3à 4hémocsur 48H, espacées de 30 à 60 min
 Si antibiothérapie dans les 10 j: faire 6 hémoculture supplémentaires
pendant 3j (2/j).
Bactériémie intermittente: 4à 6hémoc en 48H (pics), prélèvement
espacés.
Volume de sang: Le recueil d’un volume suffisant de sang est
nécessaire pour augmenter les chances d’isolement des germes, mais
un ratio (sang/bouillon) de 1/10 voire 1/5 doit être respecté, afin
d’inactiver le pouvoir bactéricide du sérum et de diluer les ATB
éventuels.
Chez l’adulte: 10 ml minimum(20 ml), car densité bactérienne faible
 Chez l’enfant: 5 ml; Chez le nouveau né, nourrisson: 1à 2ml, car
densité bactérienne plus élevée

Milieux d’hémoculture

3.2 Examen cytobactériologique du(LCR)

L'examen direct du liquide céphalorachidien (LCR) est une urgence dans laquelle le
rôle du laboratoire est fondamental: il permet très rapidement de confirmer un
diagnostic de méningite, de reconnaître une cause bactérienne et d'orienter un
traitement antibiotique. En effet, la méningite bactérienne est une maladie grave, et
c'est seulement un traitement précoce et efficace qui peut conduire à une guérison
sans séquelles.

L'analyse biologique du liquide céphalorachidien comporte trois étapes:

 l'examen direct avec l'étude cytologique et la coloration de Gram pour la recherche

des bactéries ;
 la mise en culture suivie le lendemain de l'identification et de l'antibiogramme du
micro-organisme isolé ;
 l'examen biochimique : dosage des protéines, du glucose et des chlorures.

L'étude complète du liquide céphalorachidien nécessite un laboratoire équipé pour la

microbiologie et la biochimie. Cependant, l'examen direct est réalisable facilement,
avec peu de matériel: un microscope, une centrifugeuse (si possible, même
manuelle), une cellule de Malassez et des colorants. Il est donc à la portée des
hôpitaux ou des centres de santé situés en zone rurale ou dans des petites localités
disposant seulement d'un petit laboratoire. C'est l'examen le plus intéressant car il
donne des renseignements précieux et rapides. Il peut être réalisé en moins d'une
demi-heure et les résultats doivent être transmis aussitôt.

I. Prélèvement
Il doit toujours être effectué dans des conditions d'asepsie rigoureuses, avant tout
traitement antibiotique.

Le liquide céphalorachidien est recueilli dans trois tubes stériles, remplis

successivement, avec 1 à 3 ml de liquide. Il doit être transporté en urgence au
laboratoire et traité avec le plus grand soin.

Si l'examen doit être différé, les échantillons seront conservés à 37°C pour les
cultures, et à 4°C pour l'étude des cellules.

II. Examen macroscopique

Après homogénéisation par une légère agitation, on note le degré de limpidité du
liquide et sa coloration.

 Un liquide clair (appelé souvent eau de roche) correspond soit à un liquide

normal, soit à un liquide pathologique: les liquides clairs peuvent se rencontrer
dans les méningites virales, tuberculeuses, mycosiques ou à leptospires.

 Un liquide trouble ou franchement purulent (eau de riz) correspond à une

réaction leucocytaire marquée, traduisant généralement une méningite
bactérienne ou, plus rarement, une réaction méningée inflammatoire
amicrobienne.

 En cas de piqûre d'un vaisseau au cours de la ponction, on note une

coloration rouge du liquide, plus marquée dans le premier tube que dans le
dernier, avec souvent formation d'un petit caillot.

 Les liquides sanglants ou jaunes (appelés xanthochromiques) dans les trois

tubes évoquent plutôt une hémorragie méningée, sans toutefois éliminer
systématiquement une méningite.

III. Examen microscopique

1. Numération des éléments
Après homogénéisation du liquide céphalorachidien, la numération des leucocytes et
des hématies est effectuée en cellule de Malassez (figure n° 1).

La cellule de Malassez contient 1 mm3. Elle est divisée en dix bandes de 1/10 mm3.
Chaque bande est divisée en dix rectangles de 1/,100 de mm3 (quadrillés ou non).

 Recouvrir la cellule d'une lamelle (en la faisant adhérer avec un peu de salive
déposée avec le doigt).

 S'assurer que la platine du microscope est horizontale et attendre quelques

minutes pour permettre aux éléments de sédimenter.

 Compter les leucocytes et les hématies:

selon leur abondance, compter soit toute la cellule, soit plusieurs bandes, soit
plusieurs rectangles. Faire la moyenne. Calculer et rendre les résultats par mm3.
Pour faciliter l'examen, on peut ajouter une trace de colorant (solution de bleu de
méthylène) à quelques gouttes du liquide céphalorachidien.

En cas de liquide hémorragique, il peut être difficile de différencier les hématies et

les éléments. Compter alors l'ensemble, puis dans un petit tube ajouter à 9 gouttes
de liquide céphalorachidien, 1 goutte d'acide acétique au 1/10e. Attendre quelques
minutes que les hématies soient lysées, puis compter à nouveau l'ensemble des
éléments visibles. Ajouter 10% à cette valeur pour tenir compte de la goutte d'acide
acétique. La quantité de leucocytes sera obtenue par soustraction des deux valeurs
des dénombrements.
Un liquide normal contient moins de cinq éléments par mm3.

Un syndrome méningé avec un liquide clair, voire normal, ne permet pas d'exclure une méningite
bactérienne. Si la suspicion clinique reste forte, une seconde ponction lombaire doit être effectuée dans un
délai de douze à vingt-quatre heures.

Le nombre de leucocytes oriente vers les différentes pathologies (tableau n°1).

Un liquide clair peut également s'observer dans les méningites purulentes décapitées
par un traitement antibiotique insuffisant, avec une proportion variable de
polynucléaires et lymphocytes et ceci doit être considéré comme un cas de
méningite purulente.

2. Examen qualitatif des éléments

Il doit être fait dès que le nombre de cellules dépasse dix par mm3. Centrifuger le
liquide céphalorachidien à 5 000 tours/mn pendant cinq à dix minutes dans un tube
conique stérile.

Décanter le surnageant (dans un récipient contenant de l'eau de Javel). Maintenir le

tube incliné à 45°, la partie effilée dirigée vers le haut. Introduire une effilure de
pipette Pasteur au contact du culot: celui-ci monte spontanément par capillarité. Le
répartir sur deux lames à raison d'une goutte par lame (figure n° 2). Étaler de façon à
ne pas disperser les éléments. Dans le cas d'un culot important, étaler en couche
mince, dans le cas contraire, concentrer l'échantillon sur une petite surface. Laisser
sécher.

Colorer la première lame avec du bleu de méthylène (tableau n°2),ou du colorant de

May Grunwald Giemsa. Etablir une formule en pourcentages respectifs des
polynucléaires, des lymphocytes et des monocytes (compter au moins 100
éléments).

Les liquides clairs contiennent en général une majorité de lymphocytes, alors que les
liquides troubles sont le plus souvent à prédominance de polynucléaires. On trouve:

 une majorité de polynucléaires dans les méningites bactériennes ;

 une majorité de lymphocytes dans les méningites virales, tuberculeuses, ou

mycosiques;

 parfois des formules mixtes, en particulier dans les formes de début et au

cours des méningites à Listeria.

Il faut noter que dans les premières heures d'une méningite purulente, on peut
observer une prédominance lymphocytaire ou une formule mixte et à l'inverse, au
début des méningites virales, une majorité de polynucléaires.
33. Examen bactériologique
Coloration de Gram (tableau n°3)

La deuxième lame est utilisée pour la coloration de Gram. Les bactéries sont
généralement peu nombreuses, leur forme et la façon dont elles sont groupées, leur
situation à l'intérieur ou à l'extérieur des polynucléaires et leur affinité pour les
colorants permettent avec l'habitude de faire une identification présomptive. Même si
cela n'est pas le cas, il est important de pouvoir répondre:

 s'il y a présence ou absence de bactéries visibles,

 s'il s'agit de cocci à Gram positif, de cocci à Gram négatif, de bacilles à Gram
négatif, de bacilles à Gram positif.
Il existe également des méningites à levures non capsulées (Candida), ou
capsulées (Cryptococcus neoformans). Ces dernières sont recherchées dans le culot
de centrifugation avec de l'encre de Chine: leur taille varie de 5 à 30 micro grammes.
La présence de la capsule se traduit par un halo clair autour de la levure, limité à la
périphérie par l'encre de Chine.

Conclusion

Le diagnostic bactériologique complet d'une méningite ne peut être fait qu'en mettant
en culture le liquide céphalorachidien, mais l'examen direct s'il est bien fait peut déjà
apporter des renseignements très utiles. Le liquide céphalorachidien est un liquide
précieux, disponible en petite quantité. La ponction représente un traumatisme pour
le malade. Son étude doit être faite le plus rapidement possible et il est nécessaire
de conserver le liquide pour le cas où des recherches complémentaires devraient
être effectuées.

3.3 Examen cytobactériologique des urines (ECBU)

L’ECBU, ou examen cytobactériologique des urines, recherche la présence

de germes dans les urines. Son interprétation est facile puisque l’urine est
normalement stérile mais il est important de respecter certaines
conditions de prélèvement pour éviter des résultats peu fiables.
 POURQUOI RÉALISER UNE ANALYSE
D'URINES APPELÉ ECBU ?

Lors d'une consultation motivée par des symptômes urinaires, le

médecin traitant réalise le test de la bandelette urinaire qui
recherche la présence de leucocytes (globules blancs) et
de nitrites produits lors d'une infection urinaire.

Si le test est positif et dans ceratins cas, il vous prescrit un examen

cytobactériologique des urines (ECBU), à réaliser dans un
laboratoire. Les résultats lui permettront d’adapter le traitement en
cas d'infection urinaire : cystite aiguë, pyélonéphrite aiguë.

Cet examen permet de réaliser sur un échantillon d’urine :

 une cytologie, c’est à dire l'étude des différents types de cellules

retrouvées dans l'urine (hématies ou globules rouges, leucocytes ou
globules blancs et éventuellement, cellules épithéliales recouvrant la
surface de la vessie) ;
 une bactériologie, c’est à dire la recherche, l’identification et le compte
des bactéries pouvant être présentes dans l’urine, après sa mise en
culture. Si un germe est identifié, une étude de sa sensibilité à
différents antibiotiques (antibiogramme) est réalisée. Elle guide votre
médecin dans sa prescription d’antibiotiques.

COMMENT BIEN PRÉLEVER SES URINES

POUR UN EXAMEN CYTOBACTÉRIOLOGIQUE
DES URINES ?

Le recueil de l’urine est une étape primordiale qui conditionne la

qualité des résultats de l'ECBU. Il doit donc être fait dans des
conditions d’asepsie rigoureuse.

Bien que ce prélèvement puisse avoir lieu au laboratoire (c’est le

cas pour le nourrisson), vous devez souvent le réaliser vous-même, à
votre domicile.
 Munissez-vous d’un flacon d’analyse stérile qui permet de stocker
vos urines (20 à 30 ml environ). Ce flacon est disponible chez votre
pharmacien ou dans votre laboratoire.

Il est préférable de recueillir l’urine le matin, au réveil car le

prélèvement doit être effectué au moins 4 heures après
la miction précédente ; ainsi l’urine a suffisamment séjourné dans
la vessie pour que, en cas d’infection urinaire, les bactéries soient
assez nombreuses pour une mise en culture.

Il est également nécessaire de faire l'ECBU avant de débuter un

traitement antibiotique (ou après au moins 48 heures d’arrêt d’un tel
traitement) afin de ne pas empêcher le développement des bactéries
lors de la mise en culture au laboratoire.

LIRE ET INTERPRÉTER LES RÉSULTATS DE

L’ECBU

Le laboratoire vous donne les premiers résultats de l'ECBU en

quelques heures mais les cultures des germes peuvent nécessiter
48 heures. À chaque étape, les résultats sont validées par le
biologiste du laboratoire.

Normalement, l’urine est un liquide jaune pâle, ambré, limpide à

l’émission, d’odeur safranée et légèrement acide.

Cellules présentes dans les urines (cytologie)

Les urines normales sont stériles et comprennent :

 des leucocytes (ou globules blancs) en quantité inférieure à 10 000/ml (ou

10/mm3) ;
 des hématies (ou globules rouges) en quantité inférieure à 1 000/ml (ou
1/mm3) ;
 des cellules épithéliales en petit nombre. La paroi interne de la vessie est
tapissée de cellules protectrices appelées cellules épithéliales, évacuées
par la miction ;
 éventuellement quelques cylindres hyalins et cristaux.
En cas d’infection urinaire, les taux d’hématies et de leucocytes
augmentent.

Recherche de germes (bactéries) dans les urines (bactériologie)

Des bactéries sont présentes en cas d'infection

urinaire (normalement les urines sont stériles). Leur quantité est
exprimée en unités formant colonies (UFC) par millilitre (ml).

La culture des germes présents, identifiés ou non lors de l’examen

immédiat des urines, est nécessaire pour préciser l'espèce
bactérienne et quantifier la bactériurie. Lors d’une infection
urinaire, un seul type de bactérie est généralement en cause. Cette
culture est couplée à un antibiogramme.

La bactériologie qui nécessite 48 heures, permet à votre médecin de

vous prescrire une antibiothérapie adaptée en cas d'infection
urinaire et d’obtenir ainsi une meilleure efficacité de votre
traitement, en limitant d’éventuelles résistances aux antibiotiques.

COMPRENDRE LES RÉSULTATS D'ECBU

(ANALYSE CYTOBACTÉRIOLOGIQUE DES
URINES)

Résultats de l'ECBU en l'absence d'infection urinaire

Vous n’avez a priori pas d’infection urinaire si le nombre de germes

est inférieur à 1 000 UFC/ml. Ces résultats sont valables si vous
n’avez de traitement antibiotique en cours.
 Résultats de l'ECBU en cas d'infection urinaire

Vous présentez a priori une infection urinaire si vos résultats

montrent la présence :

 de plus de 10 000/ml d’hématies (ou 10/mm3) ; ceci signe l’existence

d’une hématurie en faveur d’une infection ;
 de leucocytes dans les urines si la quantité est supérieure ou égale à 10
000/ml (soit > 10/mm3), ceci est considéré comme anormal.
La leucocyturie traduit la réponse inflammatoire à la présence d’une
infection de l’appareil urinaire. Les urines prennent alors souvent un
aspect trouble ;
 de colonies d’un germe :
o le plus souvent Escherichia coli (E coli) supérieur à 1 000 UFC/ml,
o beaucoup plus rarement Proteus mirabilis ou Klebsiella ou
Enterobacter. Dans ces cas, on ne parle d'infection urinaire que si le
taux de germes est plus élevé : taux d'au moins 10 000 UFC/ml chez la
femme et de 1 000 UFC/ml chez l'homme.

COMPRENDRE LA PARTICULARITÉ DE
CERTAINS RÉSULTATS D'ECBU

Les résultats de l'ECBU peuvent être incohérents. Cela est souvent

dû à un manque de vigilance lors du recueil des urines ou à la prise
d'antibiotiques avant le prélèvement des urines.

ECBU avec un taux de leucocytes baset présence significative de

germes (bactériurie de 1 000 à 10 000 UFR/ml) dans les urines

Cela est possible dans les situations suivantes :

 l’ECBU a été réalisé très précocement, la leucocyturie peut n’apparaître

que quelques heures après le prélèvement des urines ;
 les urines ont été contaminées par un germe local provenant du rectum ou
du vagin lors d’un prélèvement dans de mauvaises conditions. Il est alors
nécessaire de refaire l’ECBU ;
 ces résultats peuvent apparaître chez les patients immunodéprimés
présentant un taux de globules blancs sanguin bas.

ECBU avec un taux de leucocytes élevé (> ou = à 10 000) et absence de

germes dans les urines

Cela est observé dans les situations suivantes :

 la personne a reçu des antibiotiques pour suspicion d’infection urinaire

avant d’avoir fait l’ECBU. On parle alors d’infection urinaire décapitée ;
 les urines peuvent avoir été contaminées par des leucocytes du vagin, en
cas de vulvovaginite, lors d’un recueil défectueux. Il est alors nécessaire
de refaire l’ECBU ;
 ces résultats peuvent apparaître chez l’homme, présentant
une prostatite (inflammation de la prostate), une urétrite (inflammation
de l’urètre) ou une posthite (inflammation du prépuce) ;
 plus rarement, ces résultats montrent la présence d’une maladie
inflammatoire, d’une tuberculose...

ECBU mettant en évidence plusieurs types de bactéries dans les urines

recueillies

Une contamination par de multiples bactéries d’origine vaginale

aboutit généralement à ce type de résultats. En effet, en cas
d'infection urinaire, un seul type de bactérie est présent.

Il est alors nécessaire de refaire l’ECBU

3.4 Examen cytobactériologique du crachat (ECBC)

L'examen cytobactériologique des crachats, aussi appelé ECBC est un examen de biologie
médicale, étudiant les sécrétions bronchiques d'un patient. Ce prélèvement nécessite quelques
jours d'analyse (notamment pour la culture) avant de donner tous ces résultats et nécessite d'être
analysé dans un laboratoire d'analyse médicales. L'échantillon est examiné au microscope
(« examen au direct », rendu rapidement) sans et avec une coloration de Gram. Ceci permet de
noter l'éventuelle présence de germes lorsqu'ils sont en quantité suffisante pour être vus.
L'échantillon est ensuite placé en culture pour réalisation d'une numération des germes, d'une
identification bactérienne et, éventuellement d'un antibiogramme, ce qui prend plus de temps.
L'examen cytobactériologique des crachats (ECBC) analyse les crachats (= mucus épais
sécrété au niveau des bronches) ou expectorations. Difficile à réaliser et à interpréter, cet
examen porte souvent à controverse et fait partie des analyses des infections des voies
aériennes inférieures.
L'ECBC répond à trois objectifs :

 la recherche de bactéries responsables d'infections broncho-pulmonaires (pneumopathies) ;

 la détermination du traitement à mettre en place ;
 la surveillance de l'efficacité du traitement.

Précautions liées au prélèvement en vue d'un ECBC

L'ECBC est un examen difficile à réaliser et à interpréter en raison de plusieurs
difficultés techniques.

En effet, le prélèvement est souvent contaminé par des

bactéries salivaires (staphylocoques, streptocoques, corynéformes, Neisseria) ou des
bactéries commensales de l'appareil respiratoire (= qui vivent au niveau de l'appareil
respiratoire sans causer d'infections en temps normal, telles que Hæmophilus
influenzæ, Streptococcus pneumoniæ, Staphylococcus aureus, des bactéries anaérobies
strictes).

En outre, les pneumopathies sont souvent dues à l'infection par plusieurs

bactéries (infections pluribactériennes).

La présence de bactéries dans l'ECBC ne démontre donc pas toujours qu'il existe une
pneumopathie. Une attention particulière doit donc être portée aux conditions de recueil
des prélèvements :

 importance de la technique de recueil des crachats ;

 nécessité d'acheminer rapidement les prélèvements au laboratoire (moins de 2
heures).

Déroulement de l'ECBC
Contextes de prescription de l'examen

Un ECBC peut être prescrit par le médecin dans différents contextes cliniques,
notamment lorsqu'un patient présente des symptômes évocateurs d'une pneumopathie,
le médecin prescrit un antibiotique efficace sur la plupart des pneumopathies. Il ne
prescrit un ECBC que pour la recherche d'une infection par des bactéries
spécifiques (Pseudomonas aeruginosa, staphylocoque doré) ou lorsque les
symptômes s'aggravent malgré le traitement par antibiotiques.

Quelques exemples de situations rencontrées :

 Pneumopathies contractées à l'hôpital par des patients sous ventilation

artificielle ;
 Pneumopathies dues à des bactéries atypiques
(Legionella, Chlamydia, Coxiella, Mycoplasma) ;
 Pneumopathies chez un patient immunodéprimé ;
  Mucoviscidose ;
 Exacerbations de BPCO en cas d'échec d'un premier traitement antibiotique ;
 Diagnostic d'une tuberculose pulmonaire.

Les analyses effectuées

Les caractéristiques générales des expectorations sont d'abord décrites avec précision :

 l'aspect : muqueux (gelée) ; mucopurulent (avec des traces de pus) ; salivaire (fluide) ; fluide
et purulent ; visqueux, adhérent ;
 la couleur : rouille ; verdâtre ou jaunâtre ; rose à rouge si traces de sang ;
 l'odeur : parfois désagréable en lien avec la présence de certaines bactéries.

Le recueil est ensuite observé au microscope pour :

 Déterminer la présence, et éventuellement la nature, des cellules présentes (cellules

alvéolaires, macrophages, cellules épithéliales bronchiques, cellules épithéliales bucco-
pharyngées).
 Observer la flore bactérienne.

Les ECBC présentant un risque de contamination salivaire qui limite leur interprétation, des
critères de qualité permettent de distinguer les prélèvements qui peuvent être interprétés et
ceux qui doivent être recommencés :

 plus de 25 neutrophiles par champ d'observation au microscope ;

 moins de 5 à 10 cellules épithéliales par champ d'observation au microscope.

Les prélèvements répondant aux critères de qualité sont mis en culture pour détecter les
agents infectieux. Si des bactéries sont révélées par les cultures, elles sont identifiées et leur
sensibilité à différents antibiotiques testée (antibiogramme).

Interprétation des résultats de l'ECBC

Le tableau qui suit recense les principaux agents infectieux responsables de
pneumopathies identifiables à la suite d'examens cytobactériologiques de crachats :

Principaux agents infectieux responsables de pneumopathies

Agents infectieux Pneumopathi Pneumopathi Surinfectio Mucoviscido
es chez une es chez le ns se
personne patient bronchique
sans facteur hospitalisé s
de risques
Bactéries Streptococcu Fréquent Fréquent Fréquent Fréquent
s pneumoniæ
Hæmophilus Fréquent Fréquent Fréquent Fréquent
influenzæ
Staphylococc Fréquent Fréquent Fréquent Fréquent
us aureus
Moraxella Fréquent Fréquent Fréquent Fréquent
catarrhalis
 Klebsiella Fréquent Fréquent Fréquent Fréquent
pneumoniæ
Pseudomonas Exceptionnel Fréquent Fréquent Fréquent
æruginosa
Burkholderia Exceptionnel Fréquent Exceptionnel Fréquent
cepacia
Mycobactérie Cas Cas Cas Exceptionnel
s particuliers particuliers particuliers
Nocardia Cas Cas Exceptionnel Exceptionnel
particuliers particuliers
Chlamydia Cas Cas Exceptionnel Exceptionnel
pneumoniæ particuliers particuliers
Mycoplasma Cas Cas Exceptionnel Exceptionnel
particuliers particuliers
Legionella Cas Cas Exceptionnel Exceptionnel
particuliers particuliers
Coxiella Cas Exceptionnel Exceptionnel Exceptionnel
particuliers
Bactéries Exceptionnel Cas Exceptionnel Exceptionnel
anaérobies particuliers
Champigno Candida spp. Exceptionnel Cas Exceptionnel Exceptionnel
ns particuliers
Aspergillus Exceptionnel Cas Exceptionnel Cas
particuliers particuliers

La mise en évidence d'un ou plusieurs agents infectieux, associée à des symptômes

évocateurs de pneumopathie ou à un contexte particulier (patient hospitalisé, atteint de
maladie pulmonaire ou d'une mucoviscidose), oriente le médecin vers le diagnostic de
pneumopathie.

3.5 Examen cytobacteriologique des selles (coproculture)

L'examen bactériologique des selles se fait par coproculture, c'est-à-dire par

ensemencement des selles sur des milieux de culture appropriés. Le but est de
rechercher parmi une flore commensale très abondante soit des bactéries
habituellement absentes et réputées pour leur pouvoir pathogène, soit une espèce
bactérienne anormalement prédominante.

Les indications de la coproculture sont triples :

 la recherche de la cause infectieuse d'une diarrhée, qui est la plus fréquente,

 le dépistage des porteurs sains pour les métiers de l'alimentation,
 les enquêtes épidémiologiques.

Dans le cas des diarrhées infectieuses, les bactéries à rechercher systématiquement

sont Salmonella, Shigella, Campylobacter (et Yersinia dans les pays industrialisés).

Vibrio cholerae est le plus souvent recherché dans un contexte clinique particulier ou
sur une demande spécifique. Les Escherichia coli pathogènes ne peuvent
actuellement être totalement identifiés que dans des centres spécialisés (Instituts
Pasteur). Clostridium difficile est recherché dans les diarrhées aiguës consécutives à
une antibiothérapie importante.

1. Prélèvement

 Une noix de selles, dans un récipient stérile.

 Examen dans les 4 heures (conservation maximale 8 heures à 4°C).

2. Fiche de renseignements cliniques

Elle est demandée dans les pays industrialisés de façon à orienter judicieusement
les recherches en fonction des renseignements suivants

 Âge.
 Signes cliniques : fièvre, douleurs, vomissements.
 Origine géographique ou voyage récent.
 Antibiothérapie.
 Cas de diarrhée dans l'entourage.

Elle est plus difficile à obtenir dans les pays en développement, mais une fiche
même succincte est utile.

3. Examen macroscopique

 Noter l'aspect de la selle : purulent, présence de mucus, présence de sang.

 Sa consistance : liquide, molle, moulée.

4. Examen microscopique
Pour les selles liquides, on travaillera directement sur la selle.
Pour les selles moulées, il faudra faire une suspension à 10 % dans du soluté de
NaCI à 9 p. 1000.

Observer les selles à l'état frais (entre lame et lamelle) et noter la présence de :

 leucocytes ;
 hématies ;
 bactéries très mobiles (Vibrio).

Observation des selles après coloration de Gram :

 évaluer le pourcentage de bactéries Gram + et Gram -;

 rechercher les aspects caractéristiques (Campylobacter, Vibrio).

Cet examen est très important et ne doit jamais être omis. Il permet de rechercher les
leucocytes qui, en quantité supérieure à 5 par champ, sont le signe d'une diarrhée à
germe invasif, de même que la présence d'hématies. Il permet de voir aussi si la flore
est équilibrée entre bactéries à Gram positif et à Gram négatif (environ 60 % de
bactéries Gram -, et 40 % de bactéries Gram +, dans une selle normale).

5. Ensemencement, identification
Salmonella - Shigella
  Milieux d'isolement

Des milieux solides d'isolement pour entérobactéries doivent être ensemencés, soit
le milieu Salmonella - Shigella (SS), soit le milieu Hektoen. Le milieu Hektoen est
recommandé car il est mieux adapté à la culture des Shigella et plus discriminant.
Ces milieux contiennent des inhibiteurs des bactéries à Gram positif et des Proteus.
Ils contiennent aussi des sucres et des indicateurs colorés d'acidification, permettant
une orientation sur la nature des bactéries en fonction de leurs capacités à
métaboliser ces sucres.

 Milieux d'enrichissement

En même temps, pour les Salmonelles, un enrichissement doit être effectué dans un
milieu liquide contenant des inhibiteurs des autres entérobactéries. Les deux milieux
les plus utilisés sont le milieu de Muller Kauffmann qui contient des sels biliaires, du
tétrathionate et du vert brillant, ou le milieu de Leifson qui contient du sélénite de
sodium. Après 24 heures, le contenu de ce milieu est repiqué sur gélose Hektoen.

L'incubation de tous les milieux se fait à 37° C pendant 18 à 24 heures.

Les milieux Hektoen ou SS doivent ensuite être observés avec attention et les
colonies suspectes (tableau n° 1), 5 au moins, doivent être repiquées sur des milieux
urée indole.

Une urée positive permet d'éliminer les colonies de Proteus. Les milieux où la
réaction urée reste négative doivent être ensemencés sur des galeries d'identification
(milieux Kligler, mannitol, citrate, etc. ou galeries API ou autres) (tableaux n° 2,
3 et 4).

Au cas où le diagnostic biochimique conduit à l'identification de Salmonella ou

de Shigella, il doit être confirmé par l'identification antigénique.

 Identification antigénique

Pour les Salmonella qui comportent plus de 2000 sérotypes, on peut utiliser les
sérums OMA et OMB qui sont des mélanges d'agglutinines anti 0 des principaux
groupes rencontrés en pathologie humaine. Si le laboratoire en a les moyens,
l'identification est poursuivie avec les sérums anti 0 monovalents. Pour cette partie
du diagnostic qui demande à être détaillée, nous renvoyons le lecteur aux manuels
de microbiologie.

Pour les Shigella, il existe quatre sérums pour l'identification antigénique :

Sous-groupe A (S. dysenteriae)

 sérum A1 anti 1, 3, 4, 5, 6 (indole -)

 sérum A2 anti 2, 7, 8 (indole +)

Sous-groupe B (S. flexneri)

  sérum anti Shigella flexneri 6 sérotypes

Sous-groupe C (S. boydii)

 sérum C1 anti 1, 2, 3, 4 (indole -)

 sérum C2 anti 8, 10, 14 (indole -)

 sérum C3 anti 5, 7, 9, 11, 15 (indole +)

Sous-groupe D (S. sonnei)

 sérum D

Dans de nombreux pays, les souches de Salmonella et Shigella isolées doivent être
adressées à un Centre de Référence, qui collecte les données épidémiologiques
(Institut Pasteur).

Campylobacter jejuni

L'ensemencement se fait sur des milieux contenant des antibiotiques pour inhiber la
plupart des bactéries de la flore intestinale. Le plus courant est le milieu de Skirrow
contenant Vancomycine, Polymyxine et Triméthoprime.

L'incubation a lieu à 42° C en atmosphère microaérophile (correspondant au

mélange oxygène 5 %, gaz carbonique 10 %, azote 85 %). Cette atmosphère peut
être obtenue de façon simple avec des sachets à réhydrater extemporanément :
Anaerocult C mini, (Merck) ou en jarre anaérobie (Campypack biomérieux, ou
Gaspak anaérobie biomérieux sans catalyseur) ou autres réactifs du même type.

L'incubation doit durer 48 heures pour obtenir des colonies visibles. Les colonies
sont petites, brunâtres, elles peuvent être muqueuses ou en voile.

C. jejuni est un petit bacille Gram négatif fin, spiralé, très mobile avec des formes en
S, en longues spires ou en vol de mouettes. Il est catalase + et oxydase +. Il
hydrolyse l'hippurate et est sensible à la céfalotine et l'acide nalidixique.
L'identification se fait par les caractères biochimiques (tableau n° 5).

Yersinia enterocolitica

Ces bactéries peuvent être isolées sur milieu Hektoen si on les observe après 48
heures. Les colonies sont petites, de diamètre < 1 mm. Il est mieux d'utiliser un
milieu sélectif, le milieu de Schieman, contenant de la Cefsulodine, de la
Novobiocine et de l'Irgasan. Après 24 heures d'incubation à 30° C, les colonies sont
rouge sombre, d'un diamètre < 2 mm. L'identification biochimique est nécessaire car
d'autres bactéries peuvent se développer avec des colonies un peu plus grosses
mais d'aspect voisin. Elle peut se faire en galerie Api 20 E (tableau n° 6).

Vibrio cholerae

Dans les cas de choléra, l'examen direct montre une flore constituée uniquement de
vibrions. Pour la recherche de porteurs sains, l'examen direct n'est pas nécessaire.
  Enrichissement : L'ensemencement se fait à partir des selles : un tube d'eau
peptonée alcaline et un tube d'eau peptonée alcaline salée sont utilisés comme
milieux d'enrichissement. Il faut ensuite incuber pendant 3 à 6 heures à 37° C, puis
prélever une dose de la culture en surface et ensemencer un second tube d'eau
peptonée alcaline, salée ou non, ainsi qu'un milieu sélectif gélosé TCBS
(thiosulfatecitrate-bile-sucrose-agar) et les incuber une nuit à 35° C.

On doit ensemencer également avec les selles un milieu gélosé TCBS et l'incuber
une nuit à 35° C.
Sur gélose TCBS, les colonies de Vibrio cholerae sont jaunes, plates, de 2 à 3 mm
de diamètre, oxydase positive.

L'identification est faite par les caractères biochimiques (galerie API 20 E ou

autre) Tableau n° 7, et par agglutination avec les sérums anti-Vibrio cholerae anti
01 et anti 0139, à partir de colonies repiquées sur gélose nutritive.

Pour la détermination de la sensibilité au composé vibriostatique 0/129, ensemencer

un milieu gélosé Mueller-Hinton sur toute la surface de la boîte et déposer un disque
de composé. Après 24 heures à 37° C la crois sance de Vibrio cholerae est inhibée
(diamètre > 15 mm).

Escherichia coli

Escherichia coli comme toutes les entérobactéries ne présente pas d'exigences

particulières de culture. Il se développe sur les milieux SS et Hektoen. Pour
l'isolement à partir d'une selle, des milieux peu inhibiteurs comme la gélose Mac
Conkey (biomérieux) ou la gélose Drigalski (Pasteur diagnostics) sont recommandés.
L'identification repose sur les tests biochimiques classiques (tableau n° 4).

Une diarrhée à E. coli pathogène sera soupçonnée devant une selle monomorphe ne
présentant que des bacilles à Gram négatif à l'examen direct et donnant une culture
pure d'E. coli.

Au niveau des selles la différenciation entre E. coli commensaux et pathogènes se

fait par la mise en évidence des facteurs de pathogénicité : toxines, facteurs
d'adhésion ou même gènes codant pour ces différents éléments. Dans quelque
temps, grâce au développement de techniques de biologie moléculaire, ces
diagnostics pourront être effectués dans les laboratoires cliniques. Actuellement, ils
ne peuvent être effectués que dans des centres très spécialisés.

Dans le cas des EHEC (Entérohémolytic E. coli ), l'isolement sur un milieu au sorbitol
de colonies incolores (sorbitol négatif) et l'agglutination positive avec un antisérum
O157 H7 permettent une identification présomptive. Mais il ne faut pas oublier que
d'autres sérogroupes sont incriminés dans le syndrome hémolytique urémique et que
l'appartenance à ce sérogroupe n'est en aucun cas strictement corrélée à un pouvoir
pathogène.

Pour ce qui est des EPEC (Enteropathogenic E. coli), l'agglutination effectuée avec
les antisérums spécifiques des 12 sérotypes les plus souvent rencontrés (O1,11, O55,
O26 etc.) est pratiquement abandonnee, car peu significative en l'absence de mise en
évidence des facteurs de pathogénicité.

Clostridium difficile

 Culture

Elle est délicate. Elle nécessite des ensemencements en atmosphère anaérobie, sur
des milieux sélectifs à base d'antibiotiques et des techniques d'enrichissement
destinées à favoriser la germination des spores de C. difficile et éliminer une partie
des bactéries commensales.

 L'enrichissement est effectué par la technique du choc alcoolique : 1 ml de selles est

mélangé à 1 ml d'alcool éthylique absolu et incubé à température ambiante pendant 1
heure.

L'ensemencement est effectué avec 100 ml de cette suspension sur milieu CCFA.
C'est une gélose contenant cyclosérine, cefoxitine, amphotéricine B. Ces
antibiotiques inhibent la plupart des germes de la flore intestinale (entérobactéries,
streptocoques, staphylocoques, anaérobies autres que C. difficile et levures).

L'incubation se fait à 37° C en atmosphère anaérobie, pendant 36 heures.

Les colonies sont grises, à bords irréguliers, mesurent de 1 à 3 mm de diamètre et

dégagent une forte odeur fétide caractéristique, évoquant le crottin de cheval. Ce
sont des bacilles à Gram (+). Sous U.V. à 360 nm, les colonies présentent une
fluorescence verte. L'identification complète est réalisée par des tests biochimiques
(Galeries API anaérobies ou autres).

 Mise en évidence des toxines

La méthode de référence est la mise en évidence de l'action de la cytotoxine B sur

des cultures cellulaires. Elle nécessite 48 heures et ne peut être effectuée que dans
les centres spécialisés. Ces dernières années des réactifs ont été commercialisés
pour une détection directe des toxines A ou B sur les selles par des méthodes
ELISA. Ces méthodes sont simples, rapides et fiables mais restent assez onéreuses.

La recherche de C. difficile dans les selles en cas de diarrhée n'est effectuée que sur
demande spécifique du clinicien, dans un contexte particulier. Elle n'entre pas dans
les indications de la coproculture classique. Son interprétation par confrontation aux
données cliniques et endoscopiques est importante.

L'isolement d'une souche C. difficile ne permet pas de prédire son caractère

toxinogène, c'est la recherche de la toxine qui donne les résultats les plus rapides et
les plus intéressants car seules les souches toxinogènes sont pathogènes.

6. Résultat
Il doit comporter

 les examens macroscopiques (selles, liquides, molles) et microscopiques

(leucocytes, hématies) ;

 les bactéries recherchées avec "présence ou absence".

Conclusion
Les résultats d'une coproculture doivent être interprétés et confrontés aux données
cliniques. La présence d'une bactérie ne témoigne pas forcément de son caractère
pathogène. Par ailleurs il faut savoir que l'émission dans les selles, de certaines
bactéries agents de diarrhées, peut être très brève et que souvent les coprocultures
sont réalisées trop tard. En effet, il peut être difficile de recueillir des selles en cas
d'épidémie. Il ne faut pas oublier également que de nombreuses diarrhées ont une
origine virale, expliquant alors la négativité des cultures bactériennes.

Le résultat complet d'une coproculture ne peut être donné, dans les meilleures
conditions que le troisième jour suivant le prélèvement. La mise en route du
traitement se fait avant, et peut être orientée par les premières indications données
par l'examen direct.

L'étude bactériologique des selles est un examen techniquement délicat. Le

prélèvement doit être fait et conservé dans de bonnes conditions. Les milieux de
cultures doivent être de bonne qualité, et de préparation récente. Le non-respect des
conditions opératoires peut conduire à des résultats faussement négatifs. Elle
nécessite un laboratoire de bactériologie bien équipé, disposant de tout le matériel
pour réaliser des cultures et d'un personnel entraîné.
Pour toutes ces raisons l'étude bactériologique des selles ne peut être effectuée
dans tous les cas de diarrhée, mais elle a un intérêt épidémiologique important,
indispensable en santé publique. C'est le seul moyen d'isoler et d'identifier de façon
fiable les bactéries responsables des grands syndromes diarrhéiques. C'est aussi le
seul moyen de connaître et de surveiller leur sensibilité aux antibiotiques au niveau
de chaque région à notre époque où l'on assiste malheureusement, à l'émergence
d'une grande résistance aux antibiotiques parmi ces agents infectieux.

3.6 Examen cytobactériologique des suppurations

Définition :
C'est un prélèvement au niveau d'une cavité naturelle ou d'une plaie
réaliser à l'aide d'un écouvillon stérile .
. Le prélèvement sera effectué avant la mise en route du traitement
antibiotique sinon il faut signaler le traitement en cour .
Objectif :
Recherche des bactéries.
Indication :
- Analyse bactériologique du prélèvement à la recherche de la
bactérie responsable à l'infection .
- Réalisation d'un antibiogramme pour guider le médecin dans la
prescription des antibiotiques .
Déroulement de l'examen :
- Prévenir le malade.
- Lui expliquer l'examen .
- Ne pas bouger pendant le prélèvement.
- Effectuer un lavage simple des mains.
- Mettre des gants à usage unique.
- Sortir l'écouvillon de son étui sans le souiller .
- Effectuer le prélèvement en frotte l'écouvillon dans le site infecté .
- Remettre l'écouvillon dans l'étui .
- Étiqueter le tube .
- Se laver les mains.
- Achever le prélèvement au laboratoire .
- Noter le soin dans le dossier du malade et récupérer le résultat
après 36 heures.

Les suppurations fermées peuvent avoir plusieurs localisations :

- abdominale

- pelvienne

- buccale

- cérébrale

- cervicale

- ostéoarticulaire

- cellulaire sous-cutané

Il peut s'agir d'une infection :

- par contiguïté, à partir d'une flore commensale

- post-traumatique ou secondaire à des manoeuvres chirurgicales

- secondaire à une métastase septique .

Les bactéries à rechercher en fonction du type de l'infection

Site de l'infection Principales bactéries à rechercher

Abcès du cou Streptocoques

Abcès du cerveau Staphylocoques

Abcès du poumon Groupe HACEK

Anaérobies

Suppurations Entérobactéries

Cavité abdominale Entérocoques

Bacteroides

Clostridium

Péritonites pelviennes Entérobactéries

et pyosalpinx Streptocoque du groupe B,

Anaérobies

G. vaginalis

S. aureus

P. aeruginosa

C. trachomatis

N. gonorrhoeae

Os et articulations Staphylocoques

Bacilles à Gram -

Anaérobies

Tissus sous-cutanés Anaérobies

Cocci à Gram +

Bacilles à Gram -

- Les suppurations proches d'une flore commensale

Les suppurations proches de la flore bucco-dentaire : abcès du cou, abcès du cerveau, abcès
du poumon.

Les suppurations proches de la flore intestinale : péritonites, abcès intra-abdominaux, abcès

des

organes rétro-péritonéaux. Les suppurations proches de la flore vaginale : pyosalpinx et

péritonite

pelvienne.

Dans ces différentes suppurations, une lésion primitive permet aux bactéries de la flore de
voisinage de

pénétrer dans les tissus. Dans la majorité des cas il s'agit d'une infection mixte associant
bactéries aérobies

et anaérobies strictes.

- Suppurations éloignées des flores commensales

Il s'agit le plus souvent d'infections secondaires à une métastase septique ou post-traumatique.

- Os et articulation

- Abcès du cerveau

- Tissu cellulaire sous cutané

- Abcès du poumon

- Objectifs

Les bactéries à rechercher d'après le contexte

* Abcès du cou : Streptocoques, bactéries du groupe HACEK, Staphylocoques et anaérbies

(F. necrophorum et Actinomyces sont les bactéries les plus pathogènes).

* Abcès du cerveau et du poumon : Ils sont souvent secondaire à une infection loco-régionale.

Les streptocoques et les anaérobies sont les bactéries le plus souvent isolées.

* Suppuration abdominale haute post-opératoire : Staphylococcus aureus, Entérobactéries.

* Suppurations abdominales basses (péritonite secondaire à une appendicite ou une

sigmoïdite,
abcès des viscères intra-abdominaux, ou rétro-péritonéaux) : E. coli, Entérocoques,
Bacteroides fragilis, Clostridium spp.

Abcès hépatiques : Staphylocoques, Entérobactéries, anaérobies. Ils sont généralement

secondaires à

une lésion colique sous-jacente.

Principales bactéries des flores normales

Flore intestinale E. coli, Enterococcus faecalis, Bacteroides fragilis, Clostridium perfringens,

Bifidobacterium spp.

Flore bucco-pharyngée Streptococcus spp, Neisseria spp, Haemophilus spp, Staphylococcus

aureus, Eikenella, Prevotella, Fusoacterium,

Peptostreptococcus, Actinomyces.

Flore vaginale Lactobacillus spp (flore dominante), Bifidobacterium spp, gardnerella,

Ureaplasma, Mobiluncus, Prevotella, Porphyromonas asaccharolytica, Peptostreptococcus.

Peau Stapbylococcus spp, Propionibacterium acnes.

* Infections pelviennes (pyosalpinx, péritonites pelviennes) : germes des MST :

N. gonorrhoeae, C. trachomatis; bactéries de la flore vaginale : G. vaginales, P. bivia,

B. fragilis, Peptostreptococcus, Entérobactéries, streptocoques du groupe B et

M. hominis.

* Abcès prostatiques : ils sont secondaires à une urétrite ou à une métastase septique ou à

un cathétérisme urétral. Les bacilles à Gram négatif, en particulier E. coli, sont les plus

fréquemment isolés.

* Les infections ostéo-articulaires : les bactéries à isoler dépendent du contexte :

- Toxicomanies : S. aureus, Pseudomonas aeruginosa, Entérobactéries,

- Contact avec animal : Brucella, Pasteurella ,

- Post-chirurgicale ou post-traumatique : S. aureus, staphylocoques coagulase négative,

bacilles à Gram négatif, P. acnes ;

- Secondaire à une infection contiguë : Streptocoques, S. aureus, bacilles à Gram négatif,

et bactéries anaérobies strictes.

* Les infections des tissus sous cutanés (cellulites, abcès localisés)

- post-traumatiques : Clostridium perfringens, autres Clostridium, bacilles à Gram négatif,

cocci à Gram positif ;

- après morsure : Pasteurella et anaérobies.

Les prélèvements

Les prélèvements sont d'origine très diverse. La mise en évidence des bactéries pathogènes
dépend de la

localisation de la suppuration (proche ou non d'une flore commensale), du mode de

prélèvement (seringue, biopsie) et du mode de transport.

* Le prélèvement se fait :

- soit à la seringue purgée d'air en évitant de lecontaminer par la flore commensale;

- soit lors d'une biopsie (os, tissus).

Le produit pathologique étant souvent polymicrobien, il est important d'éviter pendant le

transport qu'une bactérie puisse se développer au détriment d'une autre.

Le produit pathologique est lui même un excellent milieu de transport, si la quantité prélevée
à

la seringue est supérieure à 2 ml, et si le patient n'a pas reçu d'antibiotique .

Il faut utiliser un milieu de transport si la quantité prélevée est < à 2 ml, ou si le transport est
différé.

Un bon milieu de transport doit protéger les bactèries anaérobies de l'oxygène de l'air,
empêcher

la dessiccation du produit pathologique, et préserver la multiplication ultérieure des bactéries

aérobies ou anaérobies (cf chapitre anaérobies).

- Examens bactériologiques

* L'examen direct après coloration de Gram permet d'apprécier l'importance des

polynucléaires, l'aspect monomicrobien ou polymicrobien de la suppuration.
* La mise en culture nécessite l'utilisation de milieux spécifiques et l'incubation dans
différentes atmosphères (aérobies anaérobie, C02) :

- gélose au sang, incubée en aérobiose, pour la recherche des germes aérobies;

- gélose au sang cuit + isovitalex, incubée sous C02, pour la culture des bactéries du groupe
HACEK;

- gélose au sang désoxygénée et incubée en anaérobiose (cf chapitre anaérobies);

- un bouillon anaérobie.

A ces milieux, on peut ajouter des milieux spécifiques :

- gélose lactosée sélective (désOxycholate),incubée en aérobiose, pour la culture des

différentes bactéries à Gram négatif;

- gélose Schaedler au sang et antibiotiques (néomycine 75 mg/1 et vancomycine 7,5 mg/1)

pour les bacilles à Gram négatif anaérobies;

- gélose au sang + ANC ou Néomycine pour les bactéries à Gram positif anaérobies.

La durée de l'incubation est variable. Les cultures examinées après 24 et 48 h d'incubation.

Dans contextes, l'incubation doit être prolongée.

L'identification et les antibiogrammes se limitent aux deux voire trois espèces prédominantes,
au delà il

faut une confrontation bio-clinique est indispensable. Il faut conserver les isolements durant 3
jours dans cette attente.

3.7 Examen des prélèvements broncho-pulmonaires

Examen macroscopique

Notons que cet examen macroscopique concerne seulement les

expectorations, les aspirations bronchiques et les aspirations
endotrachéales.

On décrira si l’aspect est :

 muqueux : donnant un aspect en gelée avec de rares parcelles

purulentes ;
 mucopurulent : muqueux avec des parcelles de pus plus
nombreuses ;
 salivaire ;
 fluide et purulent ;
 visqueux et adhérent.
Préciser aussi la couleur éventuellement : rouille, verdâtre,
hémoptoïque (sang). Certaines caractéristiques permettent
d’orienter le diagnostic. Ainsi, la présence de grains jaunes est
caractéristique d’une actinomycose. De même, la perception
(attention : ne pas sentir volontairement) d’une odeur fétide
témoigne de la présence d’anaérobies.

fluide et purulent salivaire

vis
queux et adhérent muqueux

Fig.9 : Différents aspects macroscopiques de crachat

© Pascal Fraperie

Le crachat lors de pneumonie lobaire aiguë est, par exemple,

fréquemment transparent, peu aéré, visqueux, très adhérent au
récipient, de couleur rouille ou gelée de coing.

Examens microscopiques
Examens microscopiques des expectorations, aspirations bronchiques et
endotrachéales

Objectifs des examens microscopiques

L’examen microscopique présente deux objectifs :

 évaluer la qualité du prélèvement en s’assurant d’une part qu’il n’a

pas été trop contaminé lors du passage par les voies aérienne
supérieures et d’autre part qu’il provient bien d’un foyer infectieux
(présence de granulocytes neutrophiles).
 observer la flore bactérienne de l’expectoration afin d’orienter
rapidement le diagnostic et choisir les méthodes pour le confirmer.

Éléments observés

Tout d’abord, c’est dans les parcelles purulentes que la probabilité

de trouver l’agent infectieux est la plus grande. Il s’agit donc de
prélever une parcelle purulente, de l’écraser entre 2 lames et de
l’étaler sur 3 lames pour coloration au MGG, Gram et Ziehl-Neelsen.

 Le fond de la préparation se compose d’un mucus hyalin, bleu (au

bleu de méthylène), réparti assez uniformément bien que formant
des zones plus épaisses par endroits. Quelquefois (cas de la
pneumonie), on pourra observer des formations d’un bleu plus foncé
en forme de goutte. Il s’agit d’un exsudat séroalbumineux.
 Un réseau de fibrine plus ou moins dense, plus ou moins bien limité,
parfois filamenteux, peut englober les granulocytes (pneumonie).
Notons enfin que le mucus hyalin prédomine dans les crachats
adhérents (pneumonie, au début dans la bronchite aiguë, congestion
pulmonaire).
 La réaction inflammatoire se traduira par la présence de
nombreux granulocytes neutrophiles.
 Des cellules d’origine variée peuvent être présentes : cellules
épithéliales pharyngées, cellules bronchiques, macrophages
alvéolaires.
 Les germes responsables de l’infection auxquels s’ajoutent
des bactéries commensales des voies aériennes supérieures.

Cellules de l’épithélium pharyngé

Grandes cellules pavimenteuses, à petit noyau central, cytoplasme

très abondant (Fig.10 et 11) = témoins de contamination salivaire.
Fig 10 : Cellules épithéliales pharyngées
© Canopé, 2013

Fig 11 : Cellule épithéliale pharyngée GRAM X1000

© Pascal Fraperie

Cellules de l’épithélium bronchique

Le schéma d’une coupe transversale de bronche permet de localiser

les cellules de l’épithélium bronchique. (Fig. 4 de la
page mécanismes de défense).

On les retrouve, en fait, plus ou moins tuméfiées dans les crachats.

En voici quelques aspects assez classiques (Fig. 12 et 13) :

1 — cellule bronchique peu déformée. Le noyau commence

cependant à se tuméfier ;
2 — cellule bronchique dont le noyau, en dégénérescence réticulée
plus avancée, s’est retiré sous l’influence de l’étalement ;
3 — aspect réticulé isolé : trace d’un noyau d’une cellule bronchique
dont le cytoplasme à disparu ;
4 — cellule bronchique presque intacte en volume, mais dont le
cytoplasme commence à s’altérer et le noyau à se tuméfier.
Fig 12 : Cellules de l’épithélium bronchique
© Canopé, 2013

Fig 13 : Cellules de l’épithélium bronchique

Cellules d’origine pulmonaire

On retrouve deux types de cellules d’origine pulmonaire dans les

expectorations : les cellules alvéolaires et les macrophages

Cellules alvéolaires (Fig. 14)

Elles correspondent aux pneumocytes II (Fig. 5 de la

page mécanismes de défense). Leur aspect est variable selon leur
degré de maturité.
Fig 14 : Cellules alvéolaires
© Canopé, 2013

Macrophages (Fig. 15 et 16)

cellules à noyau excentrique et cytoplasme clair. Certaines sont

chargées de grains d’hémosidérine et sont appelées « cellules
poussière ».

Fig 15 : Macrophages alvéolaires

© Canopé, 2013

Fig 16 : Macrophages alvéolaires

© Pascal Fraperie

Évaluation de la qualité du prélèvement

On apprécie :
  d’abord, le degré de contamination par la salive (présence
de cellules épithéliales pharyngées)
 puis l’intensité de la réaction inflammatoire (présence de
granulocytes neutrophiles). En effet, en présence de nombreux
leucocytes, on présume que le prélèvement provient bien d’un foyer
infectieux.

Pour cela, au grossissement 100 (objectif 10), on dénombre les

cellules épithéliales pharyngées et les granulocytes neutrophiles par
champ en faisant une moyenne sur 10 champs. C’est la méthode de
Murray et Washington.

Les résultats permettent de distinguer 5 classes de crachats.

Notons que pour certaines combinaisons de résultats, il n’a pas été
donné de classe.

Tableau 4

Exemples

Fig 17 : Crachat de classe 1 (MGG au Fig 18 : Crachat de classe 5 (MGG au

grossissement X400) grossissement X400)
© Pascal Fraperie © Pascal Fraperie

Description de la flore bactérienne

Pour commencer, la flore bactérienne observée au Gram au

grossissement x 1000 (objectif x 100) doit être décrite avec
précision. Il est en particulier important de noter la prédominance
d’un type bactérien car il est très probablement responsable de
l’infection. Ensuite le résultat de cet examen doit être confronté à
celui des cultures.

Examens microscopiques des lavages bronchoalvéolaires

Avec un LBA, les éléments nucléés et les hématies sont dénombrés

en hématimètre (Kowaslide, Malassez..). En absence de pathologie,
on dénombre entre 105 et 2.105 éléments/mL.
Ensuite, les autres examens microscopiques sont réalisés sur des
frottis obtenus par cytocentrifugation.

Étant donné que ce type de prélèvement est adapté au diagnostic

des pneumonies atypiques et de l’immunodéprimé, de nombreux
types de microorganismes peuvent être recherchés. Ainsi les
colorations à mettre en œuvre sont très variées :

 une coloration au MGG pour réaliser une formule leucocytaire (chez

le sujet normal 85-90% de macrophages, 5-10% de lymphocytes et
moins de 1% de granulocytes neutrophiles).
 une coloration de Gram pour observer la flore et en particulier la
présence de bactéries à l’intérieur des polynucléaires neutrophiles
(pour certains plus de 5% de granulocytes contenant des bactéries
est un signe de pneumonie).
 la coloration de Ziehl-Neelsen pour la recherche des mycobactéries
 de l’immunofluorescence direct pour la recherche de Legionella ou
de Pneumocystis jirovecii
 une coloration de Musto ou de Gomori-Grocott pour la mise en
évidence de kystes de Pneumocystis jirovecii.

Examens microscopiques des prélèvements protégés

Dans ce cas, les frottis sont réalisés par cytocentrifugation. Notons

que seules les colorations de MGG et de Gram sont conseillées pour
ces échantillons. Ensuite les modalités de lecture sont identiques à
celles du LBA.

Culture et dénombrement

Comme nous l’avons vu précédemment, le dénombrement des

germes est indispensable pour distinguer une infection d’une légère
colonisation ou d’une contamination du prélèvement par la salive.
Les prélèvements seront traités de façon à ce que ce dénombrement
soit possible.
Traitement des prélèvements

Fluidification des expectorations, aspirations bronchiques et aspirations

endo-trachéales

Effectivement, la fluidification (ou homogénéisation)

des expectorations, aspirations bronchiques et aspirations endo-
trachéales est nécessaire pour obtenir un produit fluide sur lequel il
est possible de faire des dilutions. Elle permet également de libérer
les germes emprisonnés dans la masse de mucus.
La N-acétylcystéine, contenue dans les fluidifiants, rompt les ponts
disulfures de la protéine formant le mucus, la mucine.

Il existe de nombreux protocoles pour

réaliser cette fluidification, par exemple :

 ajouter au prélèvement une solution à 5

% de N acétylcystéine de façon à le
diluer au 1/10
 ou mélanger volume à volume le
prélèvement et une solution
commercialisée par Eurobio, le Digest-
EUR®

Ces mélanges se font dans un tube à vis

stérile.
Vortexer et laisser agir 15 minutes (en Fig 19 : Fluidification d’un produit
vortexant de temps en temps). d’expectoration
© Pascal Fraperie
ATTENTION : l’ouverture du tube se fera
obligatoirement sous un PSM = risques
majeurs de génération d’aérosols
infectieux

Traitement des sécrétions de la brosse des BBP ou du cathéter distal

protégé

Les sécrétions seront décollées après agitation au vortex.

Protocoles pour une estimation quantitative de la concentration

bactérienne

On choisit le taux de dilution du prélèvement et le volume déposé

sur les milieux de culture en fonction du seuil de pathogénicité.
L’objectif étant d’obtenir environ 100 UFC (Unité Formant Colonie)
par boite quand la concentration en germe correspond au seuil de
pathogénicité.

Par exemple, pour un crachat ou une aspiration bronchique, le seuil

de pathogénicité étant de 107 UFC/mL, on peut :

 réaliser un isolement avec une anse calibrée de 10 µL à partir d’une

dilution finale 10-3 du crachat (homogénéisation + dilution)
 ou bien étaler 100 µL avec un râteau d’une dilution finale 10 -4 du
crachat (homogénéisation + dilution)

Tableau 5 : Protocoles pour un dénombrement des germes selon le

type de prélèvement

* notons que si l’examen microscopique montre la présence de

nombreux germes, une série de milieux supplémentaires sera
ensemencée avec une suspension 100 fois plus diluée.

Choix des milieux et mise en culture

La liste des milieux ensemencés est généralement déterminée à

l’avance et dépend des germes recherchés et donc des contextes
cliniques (Cf Tableau 6).

Tableau 6 : Milieux et conditions de culture

Enfin des milieux supplémentaires sont ensemencés dans le cas de
recherches particulières.

Interprétation

De nombreux microorganismes responsables d’infections

bronchopulmonaires proviennent des flores commensales des voies
aériennes supérieures et peuvent coloniser les voies aériennes
inférieures sans pour autant provoquer une infection. Pour cette
raison, il est nécessaire de distinguer une colonisation d’une
infection. C’est pourquoi il faut connaitre la concentration des
différents germes dans le prélèvement. En effet, on considère qu’un
germe est responsable d’une infection bronchopulmonaire si sa
concentration dans le prélèvement dépasse un certain seuil. Notons
que les seuils retenus dépendent du mode de recueil des
sécrétions.

L’interprétation des résultats doit également prendre en

compte l’ensemble des résultats biologiques et des renseignements
cliniques.
Les seuils définissant la pathogénicité peuvent par exemple être
abaissés dans les cas suivants :
  observation d’une flore monomorphe pathogène à l’examen direct
 antibiothérapie administrée avant de réaliser le prélèvement
 malade immunodéprimé ou mucoviscidosique

Tableau 7 : Seuils définissant la pathogénicité selon les modalités du

prélèvement
Seuil définissant la
Modalités de prélèvement
pathogénicité

Expectoration 107 UFC/mL 1 et 2

Aspiration endotrachéale et
105 UFC/mL
bronchique

Aspiration bronchique protégée 103 UFC/mL

Lavage bronchoalvéolaire 104 UFC/mL 3

Mini LBA 103 UFC/mL

Brossage bronchique protégé 103 UFC/mL

1
Pour certains auteurs l’examen bactériologique d’une
expectoration en routine doit être proscrit : en effet, ses résultats
sont aléatoires en raison de la contamination salivaire.

2
Pour un prélèvement de bonne qualité, on peut se poser la
question de la conduite à tenir face à la présence de bactéries
commensales d’origine oropharyngée (supérieure ou égale à
107 UFC par mL : streptocoques non hémolytiques, corynébactéries,
par exemple). La confrontation bioclinique est là indispensable pour
la suite à donner à l’examen.

3
Pour les bactéries des genres Nocardia, Legionella,
Mycobacterium, Actinomyces, leur présence dans un LBA à des
concentrations inférieures à 104 UFC/mL sera prise en compte.

Recherche de Mycoplasma pneumoniae

Les mycoplasmes sont des bactéries de très petite taille et ne prenant pas la coloration de
Gram.
La culture de Mycoplasma pneumoniae et la détection rapide des antigènes ne sont pas
utilisées pour le diagnostic.

La culture est trop longue et délicate, la détection des antigènes peu sensible et peu spécifique.

Le diagnostic est plus souvent réalisé par la PCR et la sérologie.

Les prélèvements recommandés sont le brossage bronchique protégé ou le lavage

bronchoalvéolaire. Etant donné le caractère diffus de l’infection, il est possible aussi de les
rechercher dans un prélèvement de gorge ou une aspiration nasopharyngée, l’écouvillon
utilisé doit être aussitôt placé dans un milieu de transport (milieu 2 SP).

Des protocoles de PCR en temps réel amplifient par exemple une séquence du gène de
l’adhésine P1 (facteur de pathogénicité essentiel, présent seulement chez cette espèce)

En sérologie

Les techniques ELISA sont les plus pratiquées en raison de leur meilleure sensibilité et
spécificité. Elles permettent de titrer séparément les IgM, IgG et IgA dirigés contre des
antigènes de Mycoplasma pneumoniae.

Mycoplasma pneumoniae n’appartient pas à la flore commensale mais en période épidémique

de nombreux sujets peuvent être colonisés sans développer pour autant une infection. Alors
que les méthodes de culture ou d’amplification génique ne permettent pas de distinguer un
état de colonisation d’un état d’infection, la sérologie est contributive. En effet les anticorps
anti-Mycoplasma pneumoniae sont secrétés seulement lors d’une infection.

Une infection récente se traduit par la présence d’Ig M chez l’enfant et l’adolescent et d’IgA
chez l’adulte (comme chez l’adulte il s’agit dans la plupart des cas de réinfection, il est rare de
retrouver des IgM)

Si le diagnostic est tardif, il s’agit alors de comparer les titres en IgG sur deux sérums
prélevés à 15 jours d’écart minimum (comparaison très recommandée car des Ig G peuvent
persister longtemps chez un individu ayant déjà développé une infection à Mycoplasma
pneumoniae).

Recherche de Chlamydophila psittaci et Chlamydophila pneumoniae

Ces bactéries ne sont pas observables après une coloration de Gram.

Le diagnostic des infections respiratoires à ces deux espèces est encore problématique. Il est
recommandé d’associer la sérologie à la mise en évidence de la bactérie par PCR.

Comme pour Mycoplasma pneumoniae, le diagnostic sérologique des infections

à Chlamydophila pneumoniae est d’interprétation difficile et repose sur l’ascension du titre
des IgG spécifiques sur 2 sérums à 3 semaines d’intervalle minimum accompagnées ou non
d’IgM, en cas de primo-infection.

Recherche des Mycobactéries

La recherche des mycobactéries est traitée dans diagnostic des infections à mycobactéries
Recherche de Nocardia

Elle s’effectue principalement sur les LBA.

Examen direct

Il est capital pour orienter l’identification. Le diagnostic présomptif de nocardiose repose sur
l’observation de bacilles à Gram positif filamenteux et quelquefois ramifiés, de coloration
irrégulière (Fig.20).
Ils présentent une légère acido-alcoolo-résistance, suffisante pour apparaître roses sur fond
bleu à la coloration de Kinyoun modifiée. On note qu’ils résistent également à la
décontamination visant à sélectionner les mycobactéries.

Fig 20 : Gram d’un produit

d’expectoration présentant des Nocardia
© Jean-Luc Gestin

Culture

De nombreux milieux conviennent à la culture des Nocardia : BCP, Columbia au sang de

mouton, gélose chocolat enrichie, gélose Sabouraud, BCYE, Loewenstein Jensen.

Pour faciliter leur isolement dans un prélèvement polymicrobien, la gélose BCYE sélective
est intéressante.
Notons que le temps de croissance dépend de l’espèce et du milieu de culture utilisé. Ainsi il
peut varier de 2 à 15 jours.

La morphologie et la couleur des colonies varient d’une espèce à une autre cependant un
grand nombre d’espèces se caractérisent par une incrustation des colonies dans la gélose et
par une odeur de terreau. La présence fréquente d’hyphes aériens se traduit par une coloration
blanche, des colonies apparaissant de loin comme « saupoudrées de sucre » (Fig.21).

Identification

Les caractères phénotypiques ne suffisent pas pour identifier le genre, notons cependant que
les Nocardia sont catalase +, nitrate réductase + et ONPG +.
Actuellement il est possible d’identifier le genre Nocardia par PCR-RFLP. C’est une méthode
au cours de laquelle est amplifiée une région de 600 pb du gène de l’ARN16S suivie d’une
digestion enzymatique avec les enzymes de restriction Mnl1 et Sac1 (les Nocardia présentent
un site de restriction pour l’enzyme Mnl1 et aucun site pour l’enzyme Sac1).

Fig 21 : Culture de Nocardia cyriacigeorgica sur gélose au sang

© Pascal Fraperie

L’identification des espèces est confiée à des laboratoires spécialisés. Les méthodes
d’identification actuellement les plus performantes font appel au séquençage partiel des
gènes hsp65, rpoB et sod et du gène codant pour l’ARN 16S. Des outils bio-informatiques
permettent de comparer les séquences obtenues à celles présentes dans des banques
génomiques.

L’Université de Lyon 1 qui est aussi l’observatoire français des nocardioses a développé la
banque génomique BIBI (bioinformatic bacterial identification), disponible sur
internet https://umr5558-bibiserv.univ-lyon1.fr/lebibi/lebibi.cgi

Recherche de Bordetella pertussis

Bordetella pertussis est l’agent de la coqueluche, une infection aiguë des voies respiratoires
basses caractérisée par des quintes de toux spasmodiques.
Le diagnostic bactériologique de la coqueluche se fait sur un prélèvement rhinopharyngé.

Recherche de Pneumocystis jirovecii

Pneumocystis jirovecii est un champignon responsable d’infection pulmonaire très grave,

survenant chez des sujets immunodéprimés, en particulier les malades du SIDA.
Le diagnostic repose sur l’examen microscopique d’un LBA après cytocentrifugation. La
coloration de MGG permet de révéler les formes végétatives alors que les colorations de
Gomori-Grocott ou Musto mettent en évidence les kystes.
Les formes végétatives sont des éléments arrondis ou ovalaires de 1,5 à 3,5 µm contenant un
noyau violet.

La morphologie des kystes évolue au cours de leur maturation : les jeunes kystes font de 3 à
6µm et possèdent un noyau, les plus âgés font 7 à 8µm et présentent jusqu’à 8 noyaux. Les
kystes sont souvent disposés en amas et présentent un aspect de « grains de raisin vidés ».
 Fig 22. Kyste de Pneumocysitis jirovecii
© Marc Pihet – CHU d’Angers

Recherche des virus

Le diagnostic des infections virales respiratoires se réalise à partir d’aspiration nasopharyngée

ou d’écouvillonnage des fosses nasales.

Auparavant, il n’existait aucune technique de diagnostic rapide puisque seules la culture virale
et la sérologie étaient employées. Désormais il est possible de mettre en évidence dans les
échantillons respiratoires soit un antigène viral par des techniques immunologiques soit un
fragment du génome viral par PCR.

Exemples :

 recherche d’antigène viral : Virus respiratoire syncitial (VRS) par méthode

immunoenzymatique, Virus de la grippe influenza A et B par méthode
immunochromatographique
 ou recherche de génome viral : l’avenir est aux méthodes PCR multiplex capables de
rechercher simultanément la présence de différents.

Recherche des Aspergillus

Examen microscopique

Dans le cas d’une aspergillose, on observe, à l’examen microscopique, des filaments

mycéliens septés, de taille régulière, ramifiés et des conidies arrondies. Comme les têtes
aspergillaires sont rarement observées et que d’autres moisissures forment des filaments
semblables aux Aspergillus, il faut attendre le résultat des cultures pour s’assurer du
diagnostic. Il est tout de même recommandé de prévenir immédiatement le clinicien, afin de
débuter un traitement antifongique, le pronostic étant très défavorable chez les
immunodéprimés.

Culture

Les Aspergillus cultivent sur gélose Sabouraud + chloramphénicol ± gentamicine (mais ce

milieu ne doit surtout pas contenir d’actidione, cette dernière inhibant leur culture). On incube
la gélose à 37°C.

L’identification de l’espèce repose sur les examens macroscopique et microscopique de la

culture. L’espèce la plus fréquemment isolée est Aspergillus fumigatus (Fig. 22 et 23).

Fig 23 : Aspect de la culture

recto/verso sur milieu
Sabouraud d’Aspergillus fumigatus
© Pascal Fraperie

Fig 24 : Tête aspergillaire d’Aspergillus

fumigatus
© Pascal Fraperie

L’isolement d’un Aspergillus ne permet pas de conclure systématiquement à une aspergillose

car ce sont des saprophytes fréquents.
Interprétation

Le rôle pathogène d’un Aspergillus isolé dans un prélèvement est d’autant plus probable que :

 l’examen direct est positif,

 la culture est abondante et rapide dans les tubes placés à 37°C,
 le prélèvement a été le plus protégé possible : LBA, aspiration endotrachéale.

Le prélèvement sera, autant que possible, renouvelé.

Autres tests

Il existe également des tests détectant dans le sérum ou le LBA, un antigène polyosidique de
l’organe de fructification d’Aspergillus : le galactomannane. Ces tests, effectués deux fois par
semaine, sont particulièrement utiles pour le suivi des patients aplasiques.

3.8 Examen bactériologique des prélèvements génitaux

• L’examen bactériologique des prélèvements génitaux est fréquemment
demandé au laboratoire d’analyse médicale. Le diagnostic n’est pas toujours
aisé et seule la connaissance parfaite de la microbiologie de l’appareil génital
de la femme et des risques de contamination de l’appareil génital de l’homme,
permet de poser le diagnostic correctement.
• Cette connaissance permet une meilleure interprétation des résultats de la
culture en distinguant les agents pathogènes qui peuvent être spécifiques ou
non spécifiques, à transmission sexuelle, et les agents pathogènes probables qui
peuvent être incriminés si leur croissance est abondante et si les premières ne
sont pas isolées.
Diagnostic bactériologique de
l’infection génitale chez l’homme :
• Le laboratoire participe au diagnostique des infections génitales suivantes :
syphilis, chancre mou, maladie de Nicholas Favre, gonococcie, les urétrites non
gonococciques etc....
• Selon l’orientation clinique, le prélèvement sera effectué à des niveaux variés :
-Chancre pour la syphilis et le chancre mou.
-Urètre pour la gonococcie et les urétrites non gonococciques.
-Ganglions pour la syphilis, la maladie de Nicholas Favre et le chancre
mou.
A) Chez l’homme
1/Ulcération :
-Syphilis : T.Pallidum
-Chancre mou : (H. ducreyii)
-Lymphogranulomatose vénérienne (Chlamydia
trachomatis)
2/Ecoulement :
-Gonococcie
-Infection à Chlamydiae
-Infection à Mycoplasme
-Candidose
-Trichomonas
B/Chez la femme
1/Ecoulement ou leucorrhée1-Vaginité à Trichomonas vaginali
2-Vaginité à Candida albicans
3-Vaginité non spécifique à Gardnerella vaginalis
4- Vaginite Neisseria gonorrhae
6- Vaginite à Streptocoque agalactiae ou du groupe B
7- Vaginite à listeria
8- Vaginite à entérobactérie
9- Infection à Chlamydiae
10- Infection à Mycoplasme
2/Ulcérations :
- Syphilis
- Chancre mou
-Lymphogranulomatose vénérienne
a)Les ulcérations :
1/ Diagnostic de la syphilis (IST) :
 Le diagnostic est uniquement direct :
l’examen au microscope à fond noir de la
sérosité du chancre recueillie par des
moyens variés, vaccinostyles, ose,
scalpel...
• L’examen au microscope à contraste de
phase est possible. Le grossissement à
utilisés : X 400 objectif à immersion
(X1000)
• Le germe se présente sous forme de
filament finement spiralés en ressort
(spirochètes) mobiles par des
mouvements de va et vient.
 Le prélèvement du chancre doit être fait avant tout traitement
antibiotique ou antiseptique, par la personne qui effectuera l’examen, car
aucun transport n’est possible (le prélèvement doit être fait au
laboratoire).
 Il n’y a pas de culture possible pour ce germe.
• La recherche d’anticorps est indispensable et systématique
(sérologie)
• La syphilis étant souvent associée à la gonococcie, la recherche
de Neisseria gonorhoeae doit être systématique.
•
a)Les ulcérations :
2/Le chancre mou : (IST)
• Le chancre mou est dû à Hemophilus decreyii. La présence d’une
ulcération génitale le plus souvent unique, très contagieuse, non indurée
(à différencier du chancre syphilitique), accompagnée d’une adénopathie
inguinale volumineuse et douloureuse en sont les symptômes classiques.
• Le bubon évolue spontanément vers la suppuration et la fistulisation.
Une syphilis associée doit être recherchée systématiquement.
 Le prélèvement :
• Il doit s’effectuer au niveau de la zone de décollement périphérique, en
grattant sans faire saigner, avec une curette ou un écouvillon d’alginate.
• La ponction du bubon s’impose. Elle doit être pratiquée à l’opposé du
point déclive. Elle permet de retirer quelques gouttes de pus jusqu’à
plusieurs millilitres, tant dans un but diagnostic que thérapeutique, car
elle évite la fistulisation.
 L’examen direct :
La mise en évidence d’Hemophilus ducreyii est délicate. C’est un bacille qui
prend mal le Gram. Le frottis réalisé avec la sérosité du chancre ou le pus du
bubon doit être coloré au bleu de méthylène ou à la coloration de Giemsa, car la
coloration de Gram ne permet pas de reconnaître ce bacille

• Sur le frottis examiné à l’immersion (X100) la

recherche de Coccobacilles à coloration bipolaire, à
bouts arrondies, en épingle de sûreté intra ou extra
cellulaire, au sein parfois d’une flore abondante de
surinfection, est longue
• Leur groupement en bancs de poisson, voir en amas de
longues chaînes parallèles est caractéristique (aspect
dit en chaînes de vélos).
 Mise en culture :
Culture difficile, de multiples méthodes ont été proposées :
-gélose trypticase-soja au sang cuit.
-gélose au sang cuit + 1% d’isovitalex

b)- Les écoulements : ou urétrites

• L’urétrite est une inflammation de l’urètre, définie par des critères
cytologiques chez un patient n’ayant pas uriné depuis deux heures. Elle
peut être considérée comme une urgence thérapeutique, du fait de sa
contagiosité et de la gravité de ses complications.
• Le diagnostic est évoqué devant un écoulement méatique purulent ou
spontané en dehors des mictions, très douloureux, associé à des brûlures
mictionnelles.
Mais le plus souvent, la symptomatologie est beaucoup moins franche :
écoulement uniquement matinal, méat collé, brûlures mictionnelles, prurit,
dysurie.
• Le diagnostic est confirmé par l’examen direct. Le frottis est anormal s’il existe plus
de 5PN/ champ au grossissement 100.
• L’examen cytobactériologique du 1er jet centrifugé est anormal si l’on observe plus de
10PN/champ au grossissement 40, dans le culot de centrifugation.
• Le frottis urétral est moins performant que l’étude du premier jet urinaire. Il est anormal
dans 75% des urétrites gonococciques et 25 % des urétrites à chlamydia, et le 1er jet
urinaire est anormal dans 95% des urétrites gonococciques et 75% des urétrites à
Chlamydia.
• Le diagnostic étiologique : Neisseria gonorhoeae, Chlamydia trachomatis et
Mycoplasma génitallium sont à eux trois responsables de plus de 60% des urétrites. Chez
l’homme, une grande partie restant de cause inexpliquée. La répartition de chacun de ces
agents pathogènes est variable, selon les pays, et dans un même pays, selon la région.
Parmi les Mycoplasmes, la responsabilité de Mycoplasma génitallium est certaine .Celle
des autres mycoplasmes est plus discutée
1) Diagnostic de la gonococcie : (IST)
• La gonococcie ou blennorragie est dû à Neisseria gonorrheae.
• L’incubation est de 3 à 5 jours parfois elle peut être plus longue. Il s’agit le
plus souvent d’une urétrite antérieur aiguë mais il existe des formes frustres
asymptomatiques.
 Prélèvement :
• Le prélèvement se fait par écouvillonnage au niveau des lésions urétrales ou
du pus d’urétrite, parfois d’un liquide prostatique.
• Le prélèvement doit être fait soit à l’aide de 2 écouvillons (l’un pour
l’examen direct, l’autre pour la culture) soit à l’Öse de platine avec laquelle le
frottis sera effectué juste après le prélèvement.
 L’examen direct :
Il précède la mise en culture, étaler l’écouvillon sur une lame (ou le
 prélèvement
à l’Öse de platine) et faire une coloration de Gram à la recherche de cocci
gram
négatif en grains de café intra cellulaire, ou une coloration au bleu de
méthylène.

  Mise en culture :
Elle se fait à 35° C sous CO2 sur gélose au sang cuit+ VCN inhibant les germes
contaminant et sur GSC simple (pour les gonocoques sensibles). On observe les
boites
après 24 à 48 heures d’incubation à la recherche de colonies petites (< 1mm) et
brillantes.
• Le test à l’oxydase permet une première approche de l’identification. Les colonies
oxydase positive sont ensemencées sur sang cuit et identifiées par l’étude de la
fermentation des sucres. (Glucose +, maltose-, fructose-, saccharose-).
 Un antibiogramme et une recherche de
bêta lactamase (à l’aide de céphalosporine
chromogène) sont effectués,
on peut utiliser des disques de cefinase,
selon le protocole du fabricant.
 1) Diagnostic des urétrites non gonococcique (UNG)
a) U N G à Chlamydiae trachomatis : (IST)
• La période d’incubation peut aller de 2 jours à 2 mois. Il peut
s’agir :
 d’une forme aiguë : elle présente la même allure qu’une urétrite
gonococcique avec miction douloureuse, écoulement purulent
abondant, accompagné parfois d’hémorragie.
 D’une forme subaiguë : la plus fréquente. Les douleurs sont peu
marquées. Le patient se plaint d’un écoulement urétral non purulent
plutôt visqueux.
 Prélèvement : Les muqueuses infectées, prélevées par un
écouvillonnage ou mieux par raclages, ou sur les culots urinaires
sont placés dans un milieu de transport spécifique et conservés à 4°C
La mise en culture se fait sur œuf de poule embryonné ou sur culture
cellulaire.

A)Ecoulement ou leucorrhées
Sont définies comme un écoulement vaginal anormal par la quantité, la qualité et
l’odeur. C’est un symptôme qui peut être la traduction d’une vaginite souvent
associée à une urétrite ou d’une cervicite, les deux pouvant être associées ou cervico-
vaginite
1/Diagnostic de la vaginite à Trichomonas vaginalis :
• L’infection est caractérisée par des douleurs (brûlures) des pertes jaunâtres, de la
dysurie
 Prélèvement : Prélever la surface vaginale à l’aide d’une pipette ou d’un
écouvillon d’alginate ou de Dacron (jamais de coton)
2 écouvillons sont nécessaires.
 Le transport doit être le plus rapide possible.
 L’examen direct : Il est possible de diluer (à minima) le prélèvement dans du
sérum physiologique.
• T. vaginalis est un protozoaire flagellé en forme de poire, doué d’une mobilité
frétillante. Utiliser le grossissement 40. On ne recherche pas de T.vaginalis par
culture ou par coloration.
2/ Diagnostic de la vaginite à Candida albicans :
L’infection est caractérisée par un prurit (brûlures vulvaires) et des
excoriations érythémateuses des lèvres et de la muqueuse.
 Le prélèvement se fait à l’écouvillon.
 L’examen microscopique (après coloration au bleu de
méthylène) montre des levures et des filaments pseudomycéliens
 La culture se fait sur milieu de Sabouraud + Gentamycine/ou
Chloramphénicol).
• Le Candida albicans est identifié par le test de filamentation
(colonies de levures inoculées dans le sérum humain et suivie par
l’apparition de filament après 1 heure d’incubation).
3/Diagnostic de la vaginite non spécifique à Gardnerella vaginalis
Cette vaginite se signale par des pertes malodorantes (odeur de poisson pourri due à des
polyamines libérées par alcalinisation).
Les symptômes réapparaissent dans 30% des cas malgré le traitement.
• Le diagnostic s’appuie sur :
a) Le PH > 4.5 (vérifié au papier PH si sécrétion abondantes)
b) Des pertes homogènes et filantes
c) L’odeur de poisson caractéristique révélée suite à la dispersion des pertes dans de la
potasse à
10% soude
d) Examen Direct : La présence de Clue cells ou cellules qui sont recouvertes d’une grande
quantité de bactérie (en utilisant des colorations type Giemsa, Pick Jacob, Papanicolaou
e) Culture : ne jamais effectuer la culture de Gardnerella vaginalis pour elle-même, du fait de
son absence de signification, si on ne fait pas de numération de germes .De plus G.vaginalis
n’est pas le seul germe impliqué (association avec les germes anaérobies).
Culture : ensemencer
- GSC+ VCN (Vancomycine +colistine +Nystatine)
-G S + ANC (Acide Nalidixique + colistine)
-Gélose Mc Conkey ou Hectoen
4/Infections génitales dues à d’autres germes :
a) Neisseria gonorhoeae :
Doit être recherché au niveau de l’endocol, dans les glandes annexes en cas de bartholinite.
Du fait
de son importance, la recherche est effectuée sur tous les prélèvements par
ensemencement sur :
-GSC + VCN : les colonies sont <1mn de diamètre
-GSC : car 3% des gonocoques sont sensibles. Les colonies sont grisâtres, oxydase
positives.
b) Streptocoque agalactiae ou B
Est recherché systématiquement dans les situations suivantes :
-Fièvre chez une femme enceinte
-Menace d’accouchement prématuré ou accouchement prématuré.
-Femme enceinte ayant déjà eu un nouveau-né porteur de streptocoque du
Groupe B
On repère les colonies fines (05) mm transparentes catalase (-), entourée d’une hémolyse
de type
bêta. L’identification est confirmée par la détermination du groupe sérologique.
a) Staphylocoque aureus :
Il est recherché en cas de syndrome de choc toxique (dû aux
tampons utilisés pendant la période de menstruation) et par
défaut sur les prélèvements venant de réanimation
d) Entérobactéries :
Elles ne sont à considérer qu’en l’absence d’autres germes et si
la culture est abondante.
e) Listeria monocytogenès:
La probabilité d’isolement est très faible mais sa pathogénicité
impose sa recherche. L’avoir toujours présente à l’esprit.
f) Chlamydia trachomatis :
• Le portage est souvent asymptomatique au niveau des voies
génitales, la transmission se fait par contact sexuel. Cet organisme
peut être la cause de cervicite et de salpingite aiguë et semble jouer
un rôle dans les stérilités.
• Le prélèvement est effectué au niveau de l’endocol généralement à
l’aide d’un écouvillon ou brosse, l’idéal est d’effectuer le
prélèvement au niveau du laboratoire.
g) Mycoplasme hominis et Ureaplasma urealyticum :
• M.Hominis serait éventuellement responsable de vaginites,
cervicites, et avortement septiques. U.urealyticum jouerait un rôle
identique et aurait une responsabilité dans certaines stérilités
inexpliquées.
A)Ulcérations :
a)Syphilis :
• Prélèvement et diagnostic se font de la même façon que chez
l’homme.
b) Chancre mou
• Le chancre mou se situe en général sur le versant cutané des
grandes lèvres, le clitoris, l’anus. Il est beaucoup plus rare chez
la femme que chez l’homme, du fait d’une résistance particulière
des muqueuses à la pénétration du germe.
B) Interprétation :
Les résultats bactériologiques demandent à être interprétés :
•
 Bactéries à pouvoir pathogène indiscutable :
-Neisseria gonorrheae
-Chlamydia trachomatis
-Tréponème pallidum
-Hemophilus ducreyii

 Bactéries dont la présence demande à être discutée qualitativement et

quantitativement en fonction du contexte clinique :
-Candia albicans (>30 colonies)
-Streptocoque agalactiae chez la femme enceinte en raison du
risque d’infection néonatal.
-Mycoplasme dont le seuil de pathogénicité > 104 UCC/ml
-Entérobactéries
-Staphylococcus aureus etc....
3.9) examen bactériologique des liquide des ponctions

L'examen cytologique du liquide articulaire est un geste simple qui peut, devant toute
arthropathie avec épanchement, renseigner sur sa nature et préciser, en particulier, si la
lésion est " inflammatoire " ou "mécanique", ce qui constitue déjà pour le médecin une étape
intéressante. C'est dans le groupe des arthropathies métaboliques, représenté surtout par la
goutte et la chondrocalcinose, que cet examen aura une valeur diagnostique déterminante
en montrant directement les microcristaux intra-articulaires responsables de l'inflammation.
Dans ces pathologies qui sont fréquentes l'examen du liquide permet, en règle, un diagnostic
rapide, précis et fiable.

I. Introduction

Le liquide articulaire est normalement présent en très petite quantité dans chaque cavité
articulaire. Son rôle est double : il agit comme lubrifiant en diminuant les frictions entre les
surfaces articulaires au cours des mouvements et il assure la nutrition du cartilage, tissu qui
ne bénéficie d'aucun apport sanguin.

L'examen du liquide apporte de nombreux renseignements sur la pathologie responsable

d'un épanchement articulaire.

L'observation de microcristaux caractéristiques qui apparaissent dans le liquide articulaire au

cours des arthropathies métaboliques apporte des renseignements précieux.

La cellularité et la formule de la population cellulaire permettent d'isoler cinq types de

liquides articulaires (tableau n° 1). Il s'agit, bien entendu, d'une indication qui n'a qu'une
valeur relative mais qui est précieuse pour le clinicien.

Le liquide articulaire normal est transparent, clair ou jaunâtre. Il devient plus opaque quand
augmente la cellularité.

Sa viscosité est en rapport avec la teneur du liquide en acide hyaluronique. Elle est élevée
dans un liquide normal ou non inflammatoire. Elle s'apprécie aisément en étirant une goutte
de liquide entre deux doigts protégés par un gant ou des doigtiers et en mesurant la
longueur du filament ainsi formé. Dans tous les liquides inflammatoires la viscosité diminue.

La formation d'un caillot est le propre des liquides pathologiques. En effet, le liquide synovial
normal est dépourvu de fibrinogène et ne coagule donc pas. En revanche, tout liquide
pathologique, surtout s'il est inflammatoire, contient de la fibrine et forme un caillot dont les
mailles enserrent les éléments cellulaires. Il est donc essentiel d'éviter la coagulation du
liquide par l'emploi d'anticoagulants.

Il. Technique

1. Recueil du liquide

Toute articulation peut être ponctionnée car l'examen n'exige qu'une quantité infime de
liquide. A la limite, une goutte suffit pour un examen à l'état frais. Le liquide est recueilli dans
un tube de plastique stérile. L'emploi d'un anticoagulant est indispensable. Le meilleur choix
est l'héparinate de sodium ; l'oxalate de calcium et l'héparinate de lithium doivent être
proscrits car ils renferment des microcristaux qui sont d'autant plus trompeurs qu'ils peuvent
être phagocytés par les polynucléaires.

Pour la même raison, il est souhaitable d'utiliser des lames soigneusement dépoussiéré et
d'éviter le dépôt sur les lames ou dans le liquide de particules diverses comme, par exemple,
le talc ou l'amidon qui lubrifient les gants.

2. Examen à l'état frais

Cette étape, la plus importante, consiste à déposer, le plus rapidement possible après le
prélèvement, une goutte (0,05 ml) de liquide articulaire sur une lame, à la couvrir d'une
lamelle et à l'examiner sans délai. La centrifugation est inutile car un liquide peu cellulaire est
rarement pathologique. L'identification des cristaux est parfois difficile et exige un matériel
optique de qualité. Un dispositif de polarisation avec, éventuellement, un compensateur et
une platine tournante permet de voir plus aisément les microcristaux, en particulier s'ils sont
peu nombreux.

À défaut de dispositif de polarisation, l'examen peut être réalisé en fermant fortement le

diaphragme de luminosité, ce qui met en évidence les éléments qui ont un indice de
réfraction différent de celui des constituants cellulaires.

On peut compléter cet examen par une numération cellulaire à la cellule de Malassez qui
constitue un élément important pour déterminer la nature et l'arthropathie (tableau n° 2).

Si l'examen immédiat est impossible il peut être différé - jusqu'à 24 heures, à condition de
conserver le liquide à 4 °C ou, mieux encore, au congélateur à - 20 °C. Il est également
possible de faire des étalements séchés à l'air ou des cytocentrifugations. Les cristaux
persistent sur les lames qui peuvent être examinées secondairement soit directement, à
l'état sec, en lumière polarisée, soit après coloration par le May Grünwald Giemsa (MGG).

3. Coloration par le MGG

L'examen à l'état frais est utilement complété par la coloration par le MGG après
cytocentrifugation qui permet de préciser, dans les meilleures conditions, la nature des
cellules présentes dans le liquide articulaire.

III. Résultats

L'examen cytologique du liquide articulaire est un élément utile aux cliniciens pour orienter le
diagnostic vers l'une ou l'autre des nombreuses affections articulaires dont le patient peut
souffrir. Pour les arthropathies métaboliques ou microcristallines, cet examen constitue
l'élément-clé du diagnostic (tableau n° 3).

1. Arthrites infectieuses

L'examen cytologique montre une très grande richesse cellulaire avec une forte proportion
de polynucléaires, souvent altérés. Si l'infection est torpide ou décapitée par les
antibiotiques, les polynucléaires sont moins nombreux et la preuve de l'infection repose sur
l'examen bactériologique du liquide ou l'examen histologique d'une biopsie de synoviale. Si
la cytologie est riche en polynucléaire éosinophiles, il est indispensable de rechercher la
présence de microfilaires (figure n° 1).
2. Rhumatismes inflammatoires
Là encore, la cellularité est importante et les polynucléaires sont les plus nombreux. Ce
groupe d'affections n'a pas de profil cytologique particulier et aucun fait précis n'oriente vers
un rhumatisme particulier. On peut seulement dire que statistiquement le liquide est plus
inflammatoire dans la polyarthrite rhumatoïde et les arthrites réactionnelles (syndrome de
Fiessinger-Leroy-Reiter) que dans la polyarthrite lupique, la pelvispondylite rhumatismale ou
le rhumatisme psoriasique.

3. Arthropathies métaboliques ou microcristallines

C'est dans ce groupe d'affections que l'examen du liquide articulaire trouve son intérêt et sa
justification. Il convient de noter que la découverte de microcristaux ne permet pas d'éliminer
une infection et qu'un examen bactériologique reste souhaitable dans tous les cas.

 Goutte

La crise de goutte est toujours liée à la présence dans la cavité articulaire d'innombrables
cristaux d'urate monosodique dont la forme et les particularités physiques sont très
caractéristiques. Il s'agit de cristaux allongés, en aiguille, mesurant 5 à 20 µm de longueur, à
extrémités effilées, transperçant les membranes cellulaires. Le liquide est le plus souvent
très inflammatoire et particulièrement riche en polynucléaires neutrophiles (figures n° 2 et 3).

Des cristaux très petits (1 à 2 µm) peuvent se voir dans les épanchements asymptomatiques
persistants au décours d'une attaque de goutte. Ils sont alors souvent extracellulaires. Les
cristaux d'urate de sodium, solubles dans l'eau, ne persistent que de façon inconstante sur
les étalements colorés par le MGG.

 Chondrocalcinose articulaire

Cette affection est due à la présence dans le cartilage et/ou la synoviale de dépôts de
cristaux de pyrophosphate de calcium dihydraté dont la libération entraîne une
symptomatologie variable allant de la crise pseudogoutteuse pour la forme la plus aiguë à
des signes simulant un rhumatisme inflammatoire ou une arthrose. La mise en évidence,
dans le liquide articulaire, des microcristaux responsables est une des clés du diagnostic. Il
s'agit de cristaux de 5 à 10 µm de long, intraleucocytaires, en forme de parallélépipède droit
ou oblique. Leur biréfringence est moindre que celle des cristaux d'urate. Ces cristaux sont
peu solubles dans l'eau et persistent après coloration par le MGG (figures n° 4 et 5).

Parfois l'examen du liquide articulaire à l'état frais ou après coloration par le MGG montre à
la fois des cristaux d'urate et de pyrophosphate. Ces arthropathies mixtes ne sont pas
exceptionnelles (figure n° 6).

 Arthropathies à phosphate de calcium

Chez certains patients, souffrant souvent de calcifications tendineuses multiples, en

particulier de la coiffe des rotateurs de l'épaule, peuvent se développer des arthropathies
destructrices et des signes d'inflammation synoviale. Ces derniers sont liés à la présence
dans le liquide articulaire de microcristaux appartenant à différentes formes de phosphate de
calcium. La plus fréquente est l'hydroxyapatite, mais on peut trouver également du
phosphate octacalcique et tricalcique. Ces cristaux mesurent 0,l à 0,2 µm de long et sont
donc invisibles au microscope optique.

 Autres microcristaux
L'examen des liquides articulaires à l'état frais révèle parfois d'autres variétés de
microcristaux. Citons :

 l'oxalate de calcium qui peut être observé chez les dialysés rénaux et forme des
cristaux, tantôt pyramidaux et faciles à reconnaître, tantôt irréguliers ou en forme de
bâtonnets qui peuvent être confondus avec le pyrophosphate de calcium ;
 le cholestérol forme des cristaux de grande taille, rectangulaire, aplatis, avec souvent
un coin encoché. On les observe dans les polyarthrites rhumatoïdes vieillies ou dans
les bursites ;
 les dérivés cortisoniques, introduits dans l'articulation dans un but thérapeutique,
peuvent persister des semaines, voire des mois. Ils peuvent d'ailleurs être
responsables de véritables arthrites microcristallines. Leur forme est variable et ils
sont toujours biréfringents :
 les cristaux de Charcot-Leyden sont rares et peuvent s'observer dans les liquides
riches en polynucléaires éosinophiles. Leur forme est celle d'une aiguille de boussole,
faiblement biréfringente.

IV. Conclusion

L'examen cytologique du liquide articulaire apporte, au prix d'un geste minime, peu invasif, et
d'une technique rapide deux éléments diagnostiques particulièrement intéressants :

 la richesse en cellules est un reflet fidèle du caractère inflammatoire d'une

arthropathie,
 la présence ou l'absence de microcristaux permet d'affirmer ou d'éliminer, en
quelques minutes, une arthropathie microcristalline, manifestation habituelle et
souvent bruyante d'une arthropathie métabolique et d'en préciser la nature.

5 Immunologie
5.1 Réaction d’agglutination