Extraction et dosage des composés phénoliques

La détermination des composés phénoliques : polyphénols totaux (PPT), flavonoïdes

totaux (FVT) et tannins condensés (TC) présents au niveau des différentes parties des plantes

étudiées a été réalisée à l’aide d’un spectrophotomètre UV-visible de type Cary 50.

1.
 Réactifs chimiques

Une série de produits chimiques ont été utilisés pour doser les composés phénoliques

des différents extraits des plantes. Le réactif de Folin-Ciocalteu est fourni par VWR

international (France), l’acide gallique, la catéchine, le nitrite de sodium (NaNO 2) et la

vanilline sont fournis par Sigma-Aldrich Chimie (France), le carbonate de sodium (Na 2CO3),

le trichlorure d’aluminium (AlCl3) et l’hydroxyde de sodium (NaOH).

 Préparation des extraits

Pour la préparation des extraits végétaux, la méthode qui a été utilisée est celle

proposée par Kim etal. (2002) puis par N’Guessanetal. (2011) avec quelques modifications.

Ainsi, 10g de poudre fine ont été macérés dans 2 x 100 ml d’une solution de méthanol-eau

(80:20 v/v). Le mélange est mis sous agitation permanente pendant 24h. Après filtration, le

filtrat obtenu a été concentré sous pression réduite à 38 °C à l’aide d’un évaporateur

rotatif.Après évaporation, le résidu est dissous dans 50 ml de méthanol et le mélange est

ajusté à 100 ml avec l’eau distillée. Enfin, le mélange obtenu est centrifugé (1536 x g)

pendant 20 minutes puis compléter à 100 ml avec une solution de méthanol-eau (50:50 v/v).

Le mélange est conservé au frais (+4 °C) en attente d’utilisation pour les analyses.

1.

Dosage des polyphénols totaux (PPT)

 Méthode utilisée pour doser les PPT
 Le dosage des polyphénols est réalisé à l’aide du réactif de « Follin-Ciocalteu »

(Waterhouse, 1999) en présence de Na2CO3. Il s’agit d’une solution d’acide

phosphotungstique (H3PW12O40) et d’acide phosphomolybdique (H3PMo12O40) dont la

réduction par l’action des polyphénols donne un mélange de complexes de sels de tungestène

(W8O23) et de molybdène (Mo8O23) de couleur bleue. Cette solution absorbe à une longueur

d’onde de 725 nm. Ainsi, le dosage des PPT se fait par comparaison de l’absorbance de la

solution étudiée par rapport à celle obtenue par un étalon qui est l’acide gallique. D’abord une

courbe d’étalonnage a été réalisée. Pour cela 500 mg d’acide gallique est dilué dans 10 ml

d’éthanol puis le volume est ajusté à 100 ml avec de l’eau distillée (Solution stock). Des

solutions diluées de concentrations connues en acide gallique ont été préparées (0, 50, 100,

150, 250 et 500 mg/L).Le dosage des PPT de chacun des échantillons se fait par comparaison

de leur absorbance à celle de la courbe d’étalonnage.

Les résultats obtenus sont exprimés en mg équivalent d’acide gallique par gramme de matière

sèche (EAG/g MS)

La courbe d’étalonnage de l’acide gallique représente l’absorbance en fonction de la

concentration en acide gallique. Elle est obtenue avec un coefficient de corrélation de 99,97%

(Figure 4).
 1.4

1.2 f(x) = 0 x − 0.01

R² = 1
Absorbance 1

0.8

0.6

0.4

0.2

0
0 100 200 300 400 500 600
Concentration des composés phénoliques (mg/L)

Figure 1 : Courbe d’étalonnage pour le dosage des polyphénols totaux

 Mesures

Pour le dosage des PPT la méthode utilisée est celle décrite par Waterhouse (1999)

avec quelques modifications. Ainsi, dans des tubes à essais on a placé 40 µl de chaque

solution à étudier puis 3,16 ml d’eau distillée sont ajoutées, ensuite 200 µl de réactif de

« Follin-Ciocalteu ». Le mélange est agité pendant 8 minutes puis on ajoute 600 µl de Na 2CO3

(20%). La solution finale est agitée une deuxième fois puis incubées pendant 40 minutes à

température ambiante et à l’abri de la lumière. L’absorbance de chaque solution est

directement mesurée au spectrophotomètre UV-visible à 725 nm. En ce qui concerne la

courbe d’étalonnage, on va utiliser l’acide gallique et les résultats obtenus sont exprimés en

mg équivalent d’acide gallique par gramme de matière sèche (EAG/g MS).

1.

Détermination des flavonoïdes totaux (FVT)

 Méthode utilisée pour doser les FVT
 Pour le dosage des flavonoïdes totaux, la méthode utilisée est celle développée par

Zhishenetal. (1999) puis par Chen et Chen, (2011) avec quelques modifications.

D’abord une courbe d’étalonnage a été réalisée en utilisant la catéchine. Des solutions de

l’ordre 0, 20, 40, 60, 80, 100 mg/L ont été préparées. Les réactifs utilisés sont : le nitrite de

sodium (NaNO2, 5%), le trichlorure d’aluminium (AlCl3, 10%) et l’hydroxyde de sodium

(NaOH, 1N).

La courbe d’étalonnage de l’absorbance en fonction de la concentration en catéchine a été

réalisée. Elle présente un coefficient de corrélation de l’ordre de 95,05%.

Les résultats obtenus sont exprimés en mg équivalent de la catéchine par gramme de matière

sèche (EC/g MS) (Figure 5).

0.14

0.12 f(x) = 0 x + 0.01

R² = 0.95
0.1
Absorbance

0.08

0.06

0.04

0.02

0
0 20 40 60 80 100 120
Concentration des flavonoïdes (mg/L)

Figure 2 : Courbe d’étalonnage pour le dosage des flavonoïdes totaux

 Mesures
 La méthode consiste à placer dans des tubes à essais et d’une manière successive, 250

µl de l’extrait étudié et 1 ml d’eau distillée. A un temps initial (0 minute) on ajoute 75 µl

d’une solution de NaNO2 (5%), après 5 minutes 75 µl de AlCl3 (10%) sont ajoutés. 6 minutes

après 500 µl de NaOH (1N) sont ajoutés ainsi que 2,5 ml d’eau distillée.

L’absorbance de chaque mélange obtenu est directement mesurée au spectrophotomètre UV-

visible à 510 nm. Les résultats obtenus sont exprimés en mg équivalent de la catéchine par

gramme de matière sèche (EC/g MS).