TD4 : Angiogenèse normale et tumorale

&
le concept de la thérapie anti-angiogénique

Malpighi M., 1686 WMD1211

Christophe Pierreux
DDUV, CELL Unit
Christophe.pierreux@uclouvain.be Vesalius A., 1543
 Cahier des charges TD5 « angiogenèse »

1.Comment former le réseau vasculaire ?

➔ Vasculogenèse et angiogenèse

2. Pourquoi et comment les tumeurs attirent les vaisseaux sanguins ?

➔ la croissance des tumeurs dépend de la vascularisation
➔ VEGF, un facteur angiogènique et l’hypoxie

3. Comment inhiber l’angiogenèse ? « from bench to bedside » ?

➔ Anti-VEGF, inhibiteurs et normalisation
 Vaisseaux sanguins

-Blood vessels are composed of cells called

endothelial cells. The total surface area covered
by these cells in an adult is 1000 m2 (=4 tennis
courts).
-No metabolically active tissue in the body is
more than a few hundred micrometers from a
blood capillary.

Copyright: Gunther von Hagens, Institute for Plastination, Heidelberg,

Germany, www.bodyworlds.com
Vaisseaux sanguins

Electron micrograph of
alveolar capillary (C) from
monkey lung with erythrocyte
(EC). Note endothelial cell
lining of capillary (EN),
processes of pericytes (P),
and the thin extensions of
squamous alveolar epithelial
cells (EP) covering the
alveolar surface. The
interstitial space (IN) is
bounded by two basement
membranes (BM) and
contains some fibroblast
processes (FB) as well as a
few connective tissue fibrils.
Vaisseaux sanguins
 Formation des vaisseaux sanguins

Les Hémangioblastes se différencient à partir de cellules souches mésodermiques et donnent

naissance aux cellules souches hématopoietiques et aux angioblastes. Les angioblastes ont
la capacité de se différencier en cellules endothéliales mais n’ont pas encore acquis tous les
marqueurs caractéristiques des cellules endothéliales.

Formation des vaisseaux sanguins

= vasculogenesis + angiogenesis
 Formation des vaisseaux sanguins : vasculogenèse

La vasculogenèse est la formation « de novo » des vaisseaux sanguins à partir des

angioblastes. Elle a lieu dans les tissus extraembryonnaire et intraembryonnaire des
embryons.

La vasculogenèse est un processus dynamique qui implique ….

- contacts cellules–cellules
- contacts cellule–matrice extracelluaire (MEC)
- contrôle par des facteurs de croissance (VEGF) et des morphogènes.
 Formation des vaisseaux sanguins : angiogenèse
L’angiogenèse est la croissance des
vaisseaux sanguins à partir de la
vasculature existante. Ce processus
assure qu’aucun tissu métaboliquement
actif de notre corps ne soit distant de plus
d’une centaine de micromètres d’un
capillaire sanguin.

Angiogenesis
Vasculogenèse et angiogenèse
Vasculogenèse et angiogenèse
Angiogenèse embryonnaire
 Angiogenèse - question

L’angiogenèse se déroule-t-elle chez l’adulte ?

Si oui, dans quelles conditions ?

Angiogenèse lors de
reconstruction de
l’endomètre (+ grossesse)

Angiogenèse lors de la
réparation tissulaire

Chez l’adulte, les cellules endothéliales sont celles qui ont le plus faible niveau de réplication
dans le corps (0.01% des cellules engagées dans la division) et l’angiogenèse est presque
totalement sous-régulée, sauf :
- système reproducteur de la femme,
- lors de blessure,
- dans la croissance pathologique des tissus (croissance tumorale, rétinopathie diabétique,
arthrite rhumatoïde, psoriasis et plus de 70 autres conditions pathologiques).
 Angiogenèse - question

Quels sont les processus cellulaires et moléculaires impliqués dans l’angiogenèse ?

Angiogenesis

activation (CE), dégradation (MEC), migration (CE), prolifération (CE)

Classes de molécules impliquées dans l’angiogenèse
 Cahier des charges TD #4 « angiogenèse »

1.Comment former le réseau vasculaire ?

➔ Vasculogenèse et angiogenèse

2. Pourquoi et comment les tumeurs attirent les vaisseaux sanguins ?

➔ la croissance des tumeurs dépend de la vascularisation
➔ VEGF, un facteur angiogène et l’hypoxie

3. Comment inhiber l’angiogenèse ? from bench to bedside?

➔ Anti-VEGF, inhibiteurs et normalisation
 Les caractactéristiques des cellules tumorales

L’angiogenèse est une des 6 caractéristiques acquises des cellules tumorales

 L’angiogenèse associée aux tumeurs

En 1971, Judah Folkman propose la théorie selon laquelle les tumeurs sont
dormantes et viables, incapable de grandir au delà de 2 à 3 mm 3 en absence de
néovascularisation (Folkman J, 1971, N Engl J Med 258:1182).
 Angiogenèse tumorale
Durant les années 60, Judah Folkman, observe deux différences entre les tumeurs
cancéreuses qu’il excise de ses patients et les tumeurs qu’il étudie dans la thyroïde
des chiens de laboratoire…

Les grandes tumeurs

sont « emmêlées »
dans un réseau
sauvage de vaisseaux
sanguins.

20X

Les tumeurs
minuscules ne sont
pas irriguées et
semblent
dormantes.
 Angiogenèse tumorale

Folkman se demande donc si les tumeurs actives ne secrètent pas « quelque

chose » qui assure la profusion, le développement des vaisseaux sanguins.
= Hypothèse de recherche fondamentale (basic research).
Et si tel est le cas, si il y a un moyen pour inhiber ce processus.
= Hypothèse de recherche appliquée (translational research or bench-to-bedside).

Tumeur ???
 Angiogenèse tumorale

La publication et l’hypothèse de Folkman ne reçurent pas un accueil enthousiaste….

Ses collègues médecins (focalisé sur la chimiothérapie) pensaient que c’était

prématuré et ridicule,
tandis que les scientifiques notaient que Folkman était un chirurgien, pas un
chercheur (et donc qu’il n’avait pas à formuler de telles hypothèses) …

Peu de scientifiques voulaient rejoindre son équipe et il lui était difficile d’obtenir des
subsides pour sa recherche….

Malgré le manque de financement, Folkman ne perdit pas courage et s’obstina avec

deux questions :

1) Est-ce que la croissance tumorale requiert de l’angiogenèse ?

(est-ce que je peux démontrer cela expérimentalement ?)

2) Qu’est-ce qui promeut l’angiogenèse ?

(est-ce que je peux identifier ce « quelque chose » ?)
 1) Est-ce que la croissance tumorale requiert de l’angiogenèse ?

Injection de cellules tumorales dans deux régions

de l’œil de lapin :
Tumeur
1) dans l’iris de lapin
2) dans l’humeur aqueuse

2
 1) Est-ce que la croissance tumorale requiert de l’angiogenèse ?

Tumeur dans
Tumeur l’humeur
aqueuse

Tumeur
dans l’iris Tumeur

Taille de la umeur
dans l’iris
Cornée

Iris

Tumeur dans
Lentille
l’humeur aqueuse

2 4 6 8 10 jours

Les cellules tumorales placées dans l’oeil de lapin poussent dans l’iris mais pas dans l’humeur
aqueuse, qui n’a pas de vaisseaux sanguins.

➔ La croissance tumorale a besoin d’angiogenèse

 2) Qu’est ce qui promeut l’angiogenèse ?

chambre avec des petits pores

cellules tumorales molécule de signalisation produite

par les cellules tumorales

Greffe de la chambre sous la peau d’une souris

Quelle est l’hypothèse que veut

tester Folkman ?

Angiogenèse

➔ Les cellules tumorales produisent une molécule de signalisation

(diffusible) qui promeut l’angiogenèse.
Angiogenèse tumorale : le modèle
 Angiogenèse tumorale : Purification du TAF

Après de nombreuses années, le laboratoire de Folkman réussit à isoler une protéine

produite par les tumeurs qui pouvait stimuler l’angiogenèse !

Science. 1984 Mar 23;223(4642):1296-9.

Heparin affinity: purification of a tumor-derived capillary endothelial cell growth
factor.
Shing Y, Folkman J, Sullivan R, Butterfield C, Murray J, Klagsbrun M.
Abstract
A tumor-derived growth factor that stimulates the proliferation of capillary endothelial
cells has a very strong affinity for heparin. This heparin affinity makes it possible to
purify the growth factor to a single-band preparation in a rapid two-step procedure. The
purified growth factor is a cationic polypeptide, has a molecular weight of about
18,000, and stimulates capillary endothelial cell proliferation at a concentration of
about 1 nanogram per milliliter.

D’autres groupes commencèrent à s’intéresser à cette hypothèse et à ce TAF !

TAF = Tumor-Angiogenesis Factor

 Angiogenèse tumorale : Purification du TAF
Napoleone Ferrara, un gynécologue-obstétricien, recruté en 1988 par
la compagnie Genentech pour développer une drogue qui accélère le
travail lors de l’accouchement, est obnubilé par ce TAF.

Il passe ses nuits et ses weekends à essayer d’isoler et d’identifier

le TAF. Après un an d’effort, il isole une protéine avec une séquence
en acides aminés qui ne ressemble à aucune protéine connue.
Ferrara la nomme vascular endothelial growth factor, ou VEGF.

Science. 1989 Dec 8;246(4935):1306-9.

Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenic mitogen.
Leung DW, Cachianes G, Kuang WJ, Goeddel DV, Ferrara N.
Department of Molecular Biology, Genentech, South San Francisco, CA 94080.
Abstract
Vascular endothelial growth factor (VEGF) was purified from media conditioned
by bovine pituitary folliculostellate cells (FC). VEGF is a heparin-binding growth
factor specific for vascular endothelial cells that is able to induce angiogenesis in
vivo. Complementary DNA clones for bovine and human VEGF were isolated from
cDNA libraries prepared from FC and HL60 leukemia cells, respectively. DNA
sequencing suggests the existence of several molecular species of VEGF.
 Angiogenèse tumorale : Role de VEGF in vivo

Bien que VEGF était le facteur de croissance le plus spécifique affectant les cellules
endothéliales et donc un candidat très prometteur pour réguler l’angiogenèse, il n’y
avait aucune preuve formelle que VEGF est une molécule importante in vivo !
Comment prouver que VEGF est une molécule importante in vivo ?

➔ Inactiver le gène codant VEGF (Knockout)

Technologie Knockout

Prix Nobel de physiologie et médecine 2007 :

Mario Capecchi, Oliver Smithies et Sir Martin Evans
 Angiogenèse tumorale : Role de VEGF in vivo (SBIM)

Technologie Knockout

Prix Nobel de physiologie et médecine 2007 :

Mario Capecchi, Oliver Smithies et Sir Martin Evans

1) Les cellules ES (Embryonic Stem cells) sont obtenues à partir du bouton

embryonnaire d’un blastocyste
 Angiogenèse tumorale : Role de VEGF in vivo (SBIM)

Technologie Knockout

Prix Nobel de physiologie et médecine 2007 :

Mario Capecchi, Oliver Smithies et Sir Martin Evans

1) Les cellules ES (Embryonic Stem cells) sont obtenues à partir du bouton

embryonnaire d’un blastocyste de souris blanche

2) Introduire un fragment d’ADN

contenant des régions
homologues au gène que l’on
veut inactiver de part et d’autre
d’un gène de résistance à un
antibiotique

3) Sélectionner les cellules

recombinées

4) Injecter dans un blastocyste

d’une souris grise
 Angiogenèse tumorale : Role de VEGF in vivo (SBIM)

5) Réimplantation du blastocyste gris, avec

cellules ES blanches recombinées, dans
l’utérus d’une femelle pseudogestante.
+/+ et +/- +/+
6) Naissance de souris chimériques grises et
blanches (ES blanches incorporées dans le
bouton embryonnaire gris) et de souris grises
(pas de ES)
+/+ et +/- +/+
7) Croiser les souris chimériques avec des
souris grises :
Si le chimérisme « touche » la lignée
germinale alors il y aura naissance de souris
blanches, hétérozygotes (+/-) pour le gène
ciblé +/- +/+ +/+

8) Accouplement entre hétérozygotes

donnera des homozygotes (-/- ou KO) pour le
gène ciblé

Fréquence ?
 Angiogenèse tumorale : Role de VEGF in vivo

Comment prouver que VEGF est une molécule importante in vivo ?

➔ Inactivation du gène codant le VEGF (Knockout)

 Angiogenèse tumorale : Role de VEGF in vivo

Injection d’encre dans le cœur d’embryons au jour embryonnaire (e) 9.5

Les embryons
+/- meurent à
e10.5 !!

➔L’absence d’une copie de VEGF in vivo perturbe le développement vasculaire,

y compris l’angiogenèse !
 La voie VEGF-VEGFR2 et l’angiogenèse

Cellule tumorale

VEGF

Récepteur à VEGF Surface de la cellule

= VEGFR2 endothéliale
Protéines-
relais
Gènes activés
dans le noyau

Protéines stimulant la
croissance des
cellules endothéliales
 Les signaux extracellulaires sont décodés, transmis au noyau
afin d’y apporter une réponse cellulaire adéquate

VEGF

Cellule endothéliale : prolifération, survie, perméabilité, formation de tube

 Angiogenèse tumorale

0-10 jours : Croissance 10-20 jours : les vaissaux 20-30 jours : croissance de
puis dormance atteignent la tumeur dormante la tumeur et des vaisseaux

Les cellules s’organisent en un amas tumoral qui se développe jusqu’à 1 mm3, puis s’arrête.
Qu’est ce qui induit la production de VEGF ?
Un réseau artério-capillaire dense se développe à partir de la jonction entre la sclérotique (le
« blanc de l’œil »), vascularisée, et la cornée (avasculaire).
Grâce à la production de VEGF, un « facteur » angiogène (qui induit la croissance
des vaisseaux sanguins)
Dès que le contact s’établit entre cette néo-vascularisation et la tumeur de 1 mm 3, la
croissance tumorale reprend vigoureusement.
 Comment l’expression de VEGF est-elle induite dans les tumeurs ?

oxygène oxygène
 La cellule « décode » l’hypoxie

La protéine VHL est mutée

(perte d’activité) dans les
cancers « clear cell » du
rein…

William G. Kaelin Jr, Gregg L. Semenza et Peter J. Ratcliffe ont découvert comment les
cellules peuvent détecter les changements de disponibilité de l'oxygène et s'y adapter.

➔ Prix Nobel de médecine en 2019

 Angiogenèse tumorale

0-10 jours : Croissance 10-20 jours : les vaissaux 20-30 jours : croissance de
puis dormance atteignent la tumeur dormante la tumeur et des vaisseaux

Les cellules s’organisent en un amas tumoral qui se développe jusqu’à 1 mm3, puis s’arrête.
La médiocre diffusion de l’O2 cause une hypoxie tumorale.
L’hypoxie est « décodée » par HIF et ceci induit l’expression de VEGF, le facteur
« angiogène »
Un réseau artério-capillaire dense se développe à partir de la jonction entre la sclérotique (le
« blanc de l’œil »), vascularisée, et la cornée (avasculaire).

Dès que le contact s’établit entre cette néo-vascularisation et la tumeur de 1 mm 3, la

croissance tumorale reprend vigoureusement.
 Angiogenèse tumorale

https://www.youtube.com/watch?v=zE4BkAw_lL4
 Cahier des charges TD #6 « angiogenèse »

1.Comment former le réseau vasculaire ?

➔ Vasculogenèse et angiogenèse

2. Pourquoi et comment les tumeurs attirent les vaisseaux sanguins ?

➔ la croissance des tumeurs dépend de la vascularisation
➔ VEGF, un facteur angiogène et l’hypoxie

3. Comment inhiber l’angiogenèse ? from bench to bedside?

➔ Anti-VEGF, inhibiteurs et normalisation
 Thérapie anti-angiogénique

Ferrara & Co :
Idée : développer des outils en se Cellule
basant sur les connaissances : tumorale
VEGF est proangiogénique Anticorps
anti-VEGF
VEGF
1) Créer un anticorps (monoclonal)
bloquant dirigé contre le VEGF
VEGFR2
➔ Réduction de la taille des tumeurs de
95% chez la souris !
Et chez l’homme ?
Cellules
endothéliale
Pas de croissance
endothéliale

Problèmes des Anticorps monoclonaux en thérapie humaine ?

Utilisation des anticorps en médecine

Essais cliniques en1997 sur des

cancers en phase avancée du
sein et du colon.
Sein : réduction de la taille mais la
survie n’est pas améliorée.
Survie

Colon : amélioration de la survie !

→ Le traitement est approuvé par
la FDA en 2004
→ Un milliard de $ de vente en
2005 !

Durée (mois)
 Thérapie anti-angiogénique
Ferrara & Co :
Idée : développer des outils en se basant
sur les connaissances : VEGF est
proangiogenique
1) Créer un anticorps dirigé contre le VEGF
➔ Réduction de la taille des tumeurs de
95% chez la souris
Folkman & Co:
Idée : isoler et utiliser des
substances/molécules anti-angiogénique
endogène (produite par l’organisme)
1) Le cartilage (avasculaire) est une source
de molécules anti-angiogénique ?
→ Expérience de greffe de cellules
tumorales dans la cornée en présence d’un
fragment de cartilage
 Thérapie ?

Thérapie anti-angiogénique :
ne fonctionne pas bien chez l’homme car amélioration transitoire et puis rechute.
Pourquoi ?
Disparition des vaisseaux → hypoxie → tumeur plus agressive !

Thérapie anti-angiogénique + chimiothérapie :

C’est un peu mieux mais seulement dans certaines circonstances (dose et timing)

Dr. Rakesh Jain (Massachusetts General Hospital, Harvard)

Utilisation alternative de la thérapie anti-angiogénique !

Analyse des vaisseaux sanguins des tumeurs

 Les vaisseaux sanguins des tumeurs

La néovascularisation tumorale (induite par un vaste excès de VEGF)

est exubérante, anarchique et perméable
➔ pression interstitielle élevée
De plus, la circulation y est chaotique !
 Nouvelles idées sur l’angiogenèse

Comme la vasculature de la tumeur est anormale, la circulation y est chaotique et la

pression interstitielle est très élevée…
- Les drogues ne sont pas délivrées correctement (Pi les empêche de sortir)

Si l’on tue les cellules endothéliales avec des molécules anti-angiogéniques :

- Les drogues ne sont pas délivrées correctement (pas de vaisseaux)
- L’oxygénation va diminuer, ce qui va rendre les cellules tumorales plus agressive.

En 2001, Dr. Jain propose de trouver la dose optimale et le « timing » d’injection des
drogues anti-angiogénique, afin de détruire quelques vaisseaux sanguins et de
rendre les autres vaisseaux plus normaux.

➔ Normalisation des vaisseaux sanguins

He encountered tremendous resistance from the scientists and physicians working on
cancer biology and treatment.

The usual response was, “Look, we’ve been told for
30 years that if we gave anti-angiogenic therapy, we would starve the tumor to death.
Now you're telling us you are going to make the blood vessels function better?”


Normalisation des vaisseaux sanguins
 Normalisation des vaisseaux sanguins
Mutation Mort des vaisseaux
Th. anti-angio +/- chimioth.
Prolifération Légère amélioration et puis
(Folkman & Ferrara)
Hypoxie tumeur plus agressive
VEGF
Angiogenèse
anormale pp
Pression interstitielle o2
Croissance tumorale
Vasculature perméable
Circulation chaotique

pp Th. anti-angio de normalisation

(Jain) Pénétration améliorée des
drogues
Mort des cellules tumorales.

pp Chimioth.