REPUBLIQUE DU CONGO

Unité*Travail*Progrès
 
 
 
 
 
PROJET DE THESE
Pour l’obtention du
DIPLOME DE DOCTORAT (PhD)
Domaine : Biologie  et  pathologies  humaines
Spécialité : Hématologie biologique

Thème :

CARACTERISATION  EPIDEMIOLOGIQUE  ET  BIOMOLECULAIRE    

DE  L’HEMOPHILIE  A,  B  ET  DES  FEMMES  CONDUCTRICES  
EN  REPUBLIQUE  DU  CONGO  
 
Présenté par
Docteur OCKO GOKABA Lethso Thibaut
e-mail : ockthib@yahoo.fr

Directeur de thèse : Professeur Awa Oumar TOURE

Co-directeur:

Année académique 2022 – 2023

Introduction
L’hémophilie est une maladie hémorragique constitutionnelle ubiquitaire. Elle est due à un
déficit en facteurs VIII (hémophilie A) ou IX (hémophilie B) de la coagulation. Sa
transmission se fait sous le mode récessif lié au sexe avec une incidence d’un cas pour 5000
naissances de sexe masculin [1]. La transmission est assurée par les femmes appelées
conductrices avec une expression clinique de la maladie chez l’homme. Le phénotype
clinique dépend de la sévérité du déficit en facteur (sévère inferieur à 1 % ; modéré entre 1 et
5 % ; et mineure entre 6 et 30%) [2]. Cependant, d’autres facteurs pourraient être impliqués,
car à concentrations plasmatiques identiques en facteurs, la fréquence des évènements
hémorragiques varient d’un patient à un autre.
L’insuffisance ou l’absence de synthèse des facteurs de l’hémophilie VIII et IX sont dues à
des mutations des gènes codant pour ces protéines [3]. Ces mutations sont entre autres les
délétions, les insertions ou les anomalies d’épissage et des inversions. L’inversion de l’intron
22 du gène du facteur VIII est associée à la survenue des inhibiteurs chez patients traités [4,
5]. Les inhibiteurs constituent la complication la plus grave de traitement de remplacement de
facteurs de coagulation. Rarement rapportés chez des patients hémophiles B (3-4%), ces
inhibiteurs touchent environ 25% d’hémophiles A. La recherche des anomalies génétiques
permet non seulement d’évaluer les options thérapeutiques vis à vis du risque génétique de
survenue des inhibiteurs mais aussi le dépistage des femmes conductrices, et le diagnostic
anténatal afin d’envisager une interruption de grossesse dans les forme sévères [6, 7].
La maladie reste peu connue en République du Congo malgré les campagnes de dépistage et
la formation du personnel soignant réalisées à Brazzaville. Huit patients porteurs d’inhibiteurs
sur quarante et huit sont suivis au centre de traitement de l’hémophilie de Brazzaville, alors
que l’effectif attendu est d’environ 577 hémophiles. Il s’agit d’une affection à risque
hémorragique important et sous diagnostiquée. Le risque hémorragique chez ces patients peut
être potentialisé par des pathologies émergentes telle la Covid 19, la fièvre hémorragique,
considérées comme un problème majeur de santé publique dans les pays tropicaux. Le Congo
a connu plusieurs épidémies dues au virus Ebola ; d’autres infections à tendance
hémorragique passent inaperçues ou sont mal diagnostiquées.
La documentation sur la caractérisation moléculaire et immunologique de l’hémophilie existe
très peu ou pas en Afrique [8, 9], et en particulier en république du Congo. Ces études ont
l’avantage de mettre en exergue les spécificités au sein des familles en terme de conseil
génétique ; dans le suivi des gestantes conductrices [10] en ce qui concerne le diagnostic
précoce des nouveau nés voire la circoncire en période néonatale; et cliniquement en terme de
phénotypes hémorragiques sévères et moyens thérapeutiques. Dans ce contexte, cette étude
sera entreprise afin de contribuer à l’amélioration de la prise en charge des patients vivants
avec l’hémophilie en république du Congo. Ainsi, les objectifs de notre étude seront :
§ Objectif général
Etudier la caractérisation épidémiologique et biomoléculaire de l’hémophilie en république du
Congo
§ Objectifs spécifiques
1. Déterminer la prévalence de l’hémophilie en république du Congo ;
2. Décrire les anomalies moléculaires de gènes des facteurs VIII et IX chez les patients et les
femmes conductrices au sein des familles dépistées ;
3. Etablir le profil des cytokines pro-inflammatoires des phénotypes hémorragiques sévères
de l’hémophilie ;
4. Etablir le profil épidémiologique des patients hémophiles porteurs des inhibiteurs anti-
facteurs VIII.
I. Cadre d’étude
L’étude sera menée en la République du Congo et au laboratoire du Centre Hospitalier
Universitaire Kremlin Bicêtre de Paris, en France. La République du Congo couvre une
superficie de 342 000 km2 pour une population de 5.657 habitants. Traversé par l'équateur et à
moitié recouvert par la grande forêt, le territoire congolais s'étend, le long des rives droites de
l'Oubangui et du fleuve Congo, dont toutefois il n'atteint pas la basse vallée. Son territoire,
résultat du découpage colonial à la fin du XIXe siècle, s'allonge de l'Atlantique au cœur de
l'Afrique centrale (Figure1). Elle s’étend sur environ 2500 Km, du Nord (Bétou) au Sud
(Pointe-Noire) et 425 kilomètres dans le sens Ouest-Est sur l’axe de l’équateur. Elle est
subdivisée en douze départements ou préfectures dont deux sont de type urbain (Brazzaville
et Pointe-Noire) et dix de type rural (Likouala, Sangha, Cuvette ouest, Cuvette centrale,
Plateaux, Pool, Bouenza, Lékoumou, Niari et Kouilou). Ce cadre nous permettra de recruter
les patients, les personnes suspectes ainsi que les femmes potentiellement conductrices de
l’hémophilie pour assurer le dépistage.
Le laboratoire du centre hospitalier universitaire Kremlin Bicêtre de Paris nous servira pour
réaliser des examens d’hémostase complémentaires ainsi que la biologie moléculaire de
l’hémophilie.
 Figure 1: Carte d’Afrique montrant la subdivision administrative de la République du Congo
à travers ses dix départements ruraux.

II. Méthodes
1. Type et période d’étude
Il s’agira d’une étude longitudinale où les patients hémophiles et femmes conductrices seront
recrutés et suivis entre le 1er janvier 2022 et le 30 juin 2024, soit une durée de deux ans et six
mois.
2. Population d’étude
La population cible sera constituée des patients hémophiles, de toutes les personnes
nouvellement reçues dans les départements du Congo pour une symptomatologie
hémorragique et des femmes potentiellement conductrices.
§ Critères d’inclusion
Seront inclus dans l’étude :
- les patients hémophiles A ou B diagnostiqués au centre de traitement de l’hémophilie de
Brazzaville ;
- des patients nouvellement reçues pour hémorragies non extériorisées (hématomes,
hémarthroses…), hémorragies extériorisées (épistaxis, saignement prolongé après
avulsion dentaire ou circoncision) ;
- les femmes identifiées comme mère d'un seul enfant hémophile, sœurs d'un hémophile,
mère d'une conductrice obligatoire, tantes, nièces, petits-enfants du côté maternel ainsi
d’autres femmes de parenté plus éloignée du côté maternel.
§ Critères de non inclusion
Toute personne présentant une maladie hémorragique autre que l’hémophilie (maladie de
Wilbrand), des saignements sous cutanés et / ou un déficit en antigène Wilbrand et
l’hémophilie acquise ne seront pas inclus dans l’étude.
3. Echantillonnage
§ Type d’échantillonnage
La sélection des patients et des femmes conductrices sera exhaustive.
§ Taille de l’échantillon
Elle a été calculée selon la formule de Schwartz.
N = t2 x p x (1-p) / m2
-­‐ N : Taille de l’échantillon minimale permettant une analyse statistique afin d’obtenir des
résultats significatifs
-­‐ t : niveau de confiance = 1,96
-­‐ p : proportion estimée de la population qui présente la maladie
-­‐ m : marge d’erreur fixée à 5%
En l’absence de la prévalence de la maladie en raison des données très variables selon les
études, la proportion estimée de la population qui présente la maladie sera de 50% soit 0,5.
N = 1,962 x 0,5 x 0,5 / 0,052 = 384

4. Procédure
Lors des consultations ou de campagnes de dépistage, une séance d’informations sera
organisée avec les patients, des femmes supposées être conductrices ou des parents des
mineurs candidats au dépistage. Cette séance consistera a expliquer les objectifs de l’étude,
l’importance du dépistage et les retombées en terme de prise en charge. Le dépistage de
l’hémophilie et la recherche des anomalies génétiques se feront en deux phases :
§ Phase pré-analytique
Les prélèvements sanguins seront faits dans deux sortes de tube :
- tube contenant de l’ EDTA destiné aux examens génétiques ;
- tube contenant du citrate tri sodique servira au bilan de la coagulation, à la vérification du
diagnostic de l’hémophilie A et de faire la recherche d’inhibiteurs.
Les échantillons seront centrifugés pour faire l’aliquotage. Les tubes à EDTA destinés à la
biologie moléculaire après centrifugation à 3500 tours/min pendant 5 min. La conservation
des aliquot se ferra à – 80° C.
Les échantillons seront conditionnés dans une boite thermostable contenant de la carboglace
et transporter vers le laboratoire du Centre Hospitalier Universitaire Kremlin Bicête de Paris.
§ Phase analytique
Le diagnostic de l’hémophilie et la recherche des inhibiteurs se feront par méthode
chronométrique à l’aide de l’automate Sysmex 600 du laboratoire d’analyses médicales du
Centre National de Référence de la Drépanocytose de Brazzaville. Le titrage des inhibiteurs
était réalisé par la méthode Bethesda (une unité Bethesda correspond à la quantité
d’inhibiteurs pouvant neutraliser 50% de l’activité d’une unité de facteur VIII ajoutée en deux
heures à 37°C.
Les analyses moléculaires se feront après extraction de l’ADN par le Kit Quiagen Blood Kit
Maxi. L’amplification sera faite par la technique de PCR Long rang (LR-PCR). Il s’agit d’une
variante des techniques de PCR qui utilise un mélange d'ADN polymérases thermostables
permettant l'amplification de fragments plus longs que ceux qui peuvent être obtenus avec une
seule enzyme.
La technique de séquençage sera utilisée pour amplifier et séquencer tous les exons des gènes
FVIII et IX dans les mêmes conditions d’amplification.
Le dosage des cytokines se ferra à l’aide d’un lecteur ELISA par ELISA sandwich.
5. Critères de jugement
Le diagnostic de l’hémophilie sera suspecté en présence des éléments de l’examen clinique
(syndrome hémorragique), l’existence d’un membre de la famille hémophile. La confirmation
diagnostique est faite par la baisse du taux des facteurs VIII et IX et par la mise en évidence
d’anomales génétiques au test de PCR.

6. Collecte des données

6.1. Sources et outils de collecte
Une fiche de collecte établie à cet effet, servira à la collecte des données en se basant sur les
registres d’admission, et les dossiers médicaux. Afin d’assurer le suivi, le contact avec les
patients sera maintenu à travers les appels téléphoniques et lors des visites de terrain.
6.2.Variables
§ Variables sociodémographiques
- Age (ans)
- Profession
- État matrimonial: célibataire, en couple, divorcé
- Provenance : département, arrondissement, quartier
- Filiation (mère d'un enfant hémophile, sœurs d'un hémophile, mère d'une conductrice,
tantes, nièces, petits-enfants du côté maternel et d’autres femmes de parenté plus éloignée du
côté maternel.
§ Variables cliniques
-­‐ Antécédent dans la famille
-­‐ Symptômes hémorragie (ORL, hémarthrose, hématome, hémorragie cerebro-méningée,
hématurie)
-­‐ Complications    
§ Variables  biologiques  
-­‐ TCA
-­‐ Ratio
-­‐ FVIII
-­‐ FIX
-­‐ Willebrand
-­‐ Inhibiteur anti FVIII
-­‐ Taux facteur résiduel
§ Thérapeutiques
-­‐ Indication du traitement
-­‐ Traitement à la demande
-­‐ Prophylaxie
-­‐ Traitement en cours
-­‐ Durée traitement
-­‐ Nombre injection
7. Considérations éthiques
Il conviendra d’obtenir le consentement éclairé de toutes les personnes à dépister. Elles seront
informées de l’objectif de l’étude et du fait que leur participation se fait sur la base du
volontariat. Leur autorisation sera demandée pour les prélèvements et la collecte de données
épidémiologiques. Les participants sont libres de se retirer de l’enquête à tout moment, sans
avoir à se justifier. Le principal avantage de l’étude est indirect, en ce sens que les données
collectées contribueront à améliorer et à orienter les activités de prise en charge. L’étude sera
menée conformément au présent protocole, aux bonnes pratiques cliniques et aux exigences
 réglementaires applicables. L’approbation en matière d’éthique sera sollicitée conformément
aux exigences nationales. La confidentialité des informations concernant les participants sera
maintenue tout au long de l’étude.
8. Analyse statistique
Le logiciel R version 4.1 servira au traitement de données. Les variables qualitatives seront
exprimées en pourcentage et son intervalle de confiance à 95%. Les variables quantitatives
seront exprimées en moyenne et son écartype. La médiane sera choisie comme tendance
centrale si l’écartype de la moyenne est supérieur au dixième de la moyenne, preuve d’une
distribution asymétrique.
9. Sources de financement
- Centre national de référence de la drépanocytose et des maladies hémorragiques
constitutionnelles
- Projet NOVONORDISK
- Laboratoire de l’hôpital Kremlin Bicêtre pour la biologie moléculaire de l’hémophilie
10. Chronogramme

Année 2022 Année 2023 Année 2024

T1 T2 T3 T4 T1 T2 T3 T4 T1 T2
Revue bibliographique
Rédaction du
protocole
Recherche
financement

Sensibilisation et
Collecte des données
Traitement des
échantillons
Participation aux
réunions scientifiques
Publications
scientifiques
Rédaction document
Présentation thèse
11. Références
1) Zimmerman B, Valentino LA. Hemophilia: in review. Pediatr Rev.2013;34(7):289–
294; quiz 295.
2) Blanchette Vs, Key Ns, Ljung Lr, Manco-­‐‑Johnson Mj, van den Berg Hm, Srivastava
A. Definitions in hemophilia: communication from the SSC of the ISTH. J Thromb
Haemost. 2014;12 (11):1935–1939.
3) Claude G. L’hémophilie aujourd’hui. Kinesither Rev 2009; 88: 32-6.
4) Mantilla CJM, Beltrán MCP, Luna ZH, Aguilar LL, Esparza FMA, López GB et
al:Frequency of intron 1 and 22 inversions of factor VIII gene in Mexican patients
with severe hemophilia A. Am J Hematol. 2007, 82:283-287.
5) Peyvandi, F., et coll., A Randomized Trial of Factor VIII and Neutralizing Antibodies
in Hemophilia A. N Engl J Med, 2016. 374, vol. 21, p. 2054-64.
6) Vinciguerra C, Frétigny M, Négrier C. Apports de la génétique dans la prise en charge
de l’hémophilie. Arch Pediatr. 2010; 17: 620-621.
7) Zarrilli F, Sanna V, Ingino R, Santamaria R, Rocino A, and al. Prenatal diagnosis of
haemophilia: our experience of 44 cases. Clin Chem Lab Med. 2013; 51(12):2233-8.
8) Hejer E, Houssein K, Edvard W, Asma J, Kaouther Z, Dorothé P and al. First report of
molecular diagnosis of Tunisian hemophiliacs A: Identification of 8 novel causative
mutations. Diagnostic Pathology 2012; 7:93-99.
9) Azza A.G, Tantawy M. Molecular genetics of hemophilia A: Clinical perspectives.
The Egyptian Journal of Medical Human Genetics, 2010: 11, 105–114.
10) Bonnet A, Chevalier Y, Wallon G, Huissoud C, Aubrun F. Gestion du péri-partum de
la patiente conductrice d’une hémophilie. Annales Françaises d’Anesthésie et de
Réanimation 2013; 32 :807–810.