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INTRODUCTION
1. Problématique
2. Question de recherche
Au regard des progrès réalisés, nous nous sommes demandé si les résultats de la
technique moléculaire seraient similaires à ceux de la technique électrophorétique
d’hémoglobine pour le diagnostic des sujets drépanocytaires.
3. Hypothèse
Nous estimons que les deux types d’analyses donneront les mêmes résultats.
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4. Objectif général
7. Intérêt du travail
L’intérêt de ce travail est de fournir les informations sur les deux méthodes de
diagnostic de la drépanocytose, afin de garantir une bonne prise en charge de ces
sujets.
8. Subdivision du travail
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Ce travail est subdivisé en deux grandes parties, la première partie se base sur
les généralités et la seconde partie est consacrée sur l’expérimentation au
laboratoire ainsi que sur les résultats et discussion.
I.1.1. Définition:
Lorsqu'on a reçu un seul allèle muté, on est porteur sain. Ainsi donc, lorsque les
deux parents sont porteurs sains, leur risque de concevoir un enfant souffrant de la
maladie est de 1sur 4, soit 25%. Par contre lorsqu'un couple comporte un porteur
sain et un malade, ce risque est de 1 sur 2 soit 50 %.( 1,6)
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Les caractéristiques anormales des globules rouges ont été décrites pour la première
fois en 1910 par Ernest Irons (en) et James Herrick à partir du cas de Walter
Clement Noel, un étudiant en odontologie d'une vingtaine d'années originaire de la
Grenade, dans les Antilles: ce patient était traité à Chicago pour une anémie depuis
1904, puis pour des « rhumatismes musculaires » et des « attaques biliaires », avant
de mourir d'une pneumonie à Saint-Georges en 1916.
L'observation d'un frottis sanguin montra des globules rouges de forme inhabituelle
en faucille c'est-à-dire « falciforme » ou en feuille d'acanthe, résultat publié en
novembre 1910. (8,9)
C’est en 1933 que furent ainsi décrits la drépanocytose d'une part, et le trait
drépanocytaire d'autre part, grâce aux travaux de Lemuel Diggs, mais il fallut
attendre 1949 pour que James Neel établisse les propriétés génétiques de la maladie
et l'existence d'une forme homozygote héritée de parents hétérozygotes.
C'est également en 1949 que les Américains Linus Pauling et Harvey Itano,
décrivirent la solubilité anormale de l'hémoglobine S et attribuèrent ces anomalies à
la molécule d'hémoglobine elle-même, la discrimination entre hémoglobine S et
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I.1.3. Épidémiologie
I.1.4.1.Génétique
L'une de ces sous-unités est dite α (alpha) et est codée par un gène situé sur le
chromosome 16 tandis que l'autre sous-unité est codée par un gène du chromosome
11 et est soit de type β (bêta), γ (gamma) ou δ (delta), donnant respectivement
l'hémoglobine A de formule α2β2 et notée HbA, l'hémoglobine F de formule α2γ2
et notée HbF, et l'hémoglobine A2 de formule α2δ2 et notée HbA2. L'hémoglobine
A est de loin la plus abondante des trois, constituant environ 95 % de
l'hémoglobine totale d'un adulte sain. (12)
La chaîne β produite ne diffère donc d'une chaîne β normale que par un seul résidu
d'acide aminé, en position 6 selon la nomenclature historique, ou 7 selon la
nomenclature actuelle. L'hémoglobine résultante est dite S, initiale du mot anglais
sickle signifiant « faucille », et est notée HbS, de formule α2βS2.
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Ils ont une certaine importance clinique, car certains sont associés à une production
accrue d'hémoglobine fœtale HbF, notamment Sénégal et arabo-indien, d’avantage
que Bénin et Cameroun, ce qui tend à atténuer les complications de la maladie. (13)
est nulle si l'un des deux parents est sain et ce même si l'autre parent est
drépanocytaire.
Il existe parallèlement des hétérozygotes dits composites, ou doubles, associant
la drépanocytose (allèle S) avec une autre hémoglobinopathie, notamment
l'hémoglobine C, voire l'hémoglobine E (thalassémie β). La forme SC est la plus
courante d'entre elles, formant une hémoglobine HbSC de formule α2βSβC. (14,
15)
Avantage de l’état hétérozygote AS
Cette hématie de forme anormale tend à se bloquer dans les petits vaisseaux
formant des thromboses; le trouble circulatoire qui en résulte aggrave la
désaturation locale en oxygène et par conséquent la falciformation. (17)
la vaso-occlusion
L’hémolyse.
Vaso-occlusion :
Les douleurs aiguës et chroniques sont les effets à long terme des crises vaso-
occlusives (CVO). (4)
Hémolyse et vasculopathie :
La régulation du tonus vasculaire dépend d’un équilibre subtil entre des médiateurs
produits par l’endothélium tels l’endothéline-1 (ET-1), à action vaso-constrictrice,
et le monoxyde d’azote (NO), à action vaso-dilatatrice. (4)
Les signes cliniques de la maladie débutent dans les premiers mois ou les
premières années de la vie, quand l’hémoglobine S a progressivement remplacé
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- Ulcères de jambe: Ils siègent dans les régions des chevilles et sont favorisés
par les traumatismes. Leur guérison est difficile à obtenir et la récidive est la
règle.
On observe alors à l'état frais, entre lame et lamelle, les hématies qui prennent
progressivement la forme typique en "faucille". Ce test est peu sensible, contre-
indiqué avant l'âge de 6 mois; et ne différencie pas le profil SS du profil AS. (22)
Ces agents cristallisent l'HbS et précipitent les cellules, qui réfractent la lumière
et provoquent la turbidité de la solution. Le résultat est comparé à des contrôles
négatifs et positifs.
Ce test est facile à réaliser et peu coûteux. Toutefois, Il souffre d'un résultat
faussement négatif lorsqu'il est réalisé chez les nouveau-nés, du fait de quantité
excessive d'hémoglobine F, et lorsque l'HbS est inférieure à 10% de l'hémoglobine
totale.
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De plus, des résultats faussement négatifs sont observés chez les patients présentant
une Co-hérédité du trait a-thalassémique et une anémie sévère.
En revanche, des faux positifs sont observés chez les patients présentant une
viscosité sérique élevée, une érythrocytose, une leucocytose très marquée et dans
certains cas une anémie. (22, 23)
Electrophorèse d'hémoglobine
Dans ce test, un champ électrique est appliqué pour faciliter la migration des
molécules chargées électriquement. Le premier variant d'hémoglobine HbS décrit
en utilisant l'électrophorèse date de 1949. (24)
L'électrophorèse alcaline est un outil de diagnostic qui a été utilisé pour détecter la
thalassémie et l'anémie falciforme à pH 8, 4. Tout d'abord, un hémolysat est
préparé à partir des globules rouges; puis, il est ajouté à une bande de cellulose et
un tampon de rodage à une tension constante dans une chambre d'électrophorèse.
En conséquence, les différents types d'hémoglobine avec des charges nettes
différentes sont séparés en différentes bandes en fonction de leur mobilité.
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De plus, des plus petites bandes telles que l'HbA2, HbH et Hb Bart peuvent parfois
manquées. Par conséquent, un test plus efficace devrait être utilisé comme test de
diagnostic pour surmonter ces limitations. (25, 26)
Généralement, il peut fournir le résultat en 45 min. Bien que l'IEF soit relativement
coûteux et nécessite un personnel hautement qualifié pour interpréter les résultats
en raison du plus grand nombre de bagues, il est toujours considéré comme le test
standard pour le dépistage néonatal, car il nécessite un très petit volume
d'échantillon et peut être utilisé avec du sang séché. (25)
Principe
Elle permet de détecter les hémoglobines anormales chez le nouveau-né alors que
l'hémoglobine F est le composant hémoglobinique majeur dans les premiers mois
de la vie. Permet aussi de caractériser l'hémoglobine S.
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C'est la technique standard la plus simple à mettre en œuvre. Elle sépare les
différentes hémoglobines en fonction de leur charge et de la position de l'acide
aminé muté dans la molécule, les hémoglobines qui ont un gain de charge positive
migrent plus lentement vers l'anode. Elle permet une bonne séparation des
différentes fractions hémoglobiniques normales: A, F, A2 et le dépistage des
syndromes thalassémiques.
En effet, elle permet de séparer les variantes ayant la même mobilité que les
hémoglobines A, S ou C sur acétate de cellulose. Elle permet une très bonne
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Cette technique met en évidence toute substitution d'acides aminés impliquant une
différence d'hydrophobicité de la chaîne latérale de l'acide aminé concerné, même
en l'absence de différence de charge.
Elle permet de séparer les deux chaînes 'Y qui ne diffèrent entre elles que par un
résidu méthyl (y136 Ala ou Gly). Cette technique permet la séparation de la chaîne
de globine normale et de la chaîne mutée de l'hémoglobine instable (30).
Plus de 300 maladies génétiques humaines différentes sont causées par des
mutations d'un seul gène. De fait, une maladie ou un dysfonctionnement dû à un
gène défectueux apparait dans environ 1 % de la population humain. Des mutations
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Elle a été décrite en 1985 par K Mullis et coll. Elle se déroule dans un tube PCR
qui est introduit dans un Thermocycleur (appareil sur lequel on peut programmer
des cycles de durée et de température variables). (30)
Au cours de cette technique, le produit issu d'une première PCR est de nouveau
amplifié à l'aide d'un second couple d'amorce, qui s'hybride à une partie interne
(nichée) de la séquence amplifiée d'hybridation, elles se positionnent en face de
leurs séquences complémentaires respectives. Puis en faisant agir une ADN
Polymérase (Taq Polymérase), chaque amorce est allongée dans le sens 5' ------ 3'
d'une séquence exactement complémentaire du brin recopié. (25, 32)
L'ADN
Amorce :
Ce sont des molécules de base, constituant l'ADN, et qui sont utilisés par la Taq
polymérase afin de synthèse le nouveau brin d'ADN complémentaire.
Le cofacteur est une substance dont la présence est nécessaire en plus d'une enzyme
pour qu'une réaction se déroule. Le magnésium (Mg 2+) est le cofacteur le plus
couramment utilisé.
Taq polymérase :
Le déroulement de la réaction
La PCR est une technique automatisée au cours de laquelle la réaction fait dans un
Thermocycleur. Cet appareil contient un bloc chauffant dans lequel on insère les
différents tubes contenant notre mélange pour la réaction de PCR, et un clavier
pour la programmation de cycles. Le Thermocycleur est alors programmé pour
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effectuer les différents cycles de la PCR. Ainsi donc, chaque cycle est composé
d'une succession de paliers de température prédéterminée, et d'une durée bien
définie. Chaque cycle est donc constitué de trois périodes différentes:
dénaturation,
hybridation;
élongation.
La détection des produits de PCR varie selon le mode de PCR, dans la PCR
classique, la détection est faite en end-point (à la fin des réactions de PCR).
Le produit d'une PCR est constitué d'un ou de plusieurs fragments d'ADN (la ou les
séquences d'intérêt). La détection se fait grâce aux enzymes de restriction.
Ces enzymes clivent l’ADN quand elles rencontrent une séquence de bases
spécifique (site de restriction). La mutation peut aussi abolir le site de clivage de
l’enzyme.
Le résultat dans les deux cas donne lieu à des différences (« polymorphismes
») dans la longueur des fragments de l’ADN générés par rapport au témoin de
référence d’où le terme RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisme).
II. 1. MATERIELS
II.1.1. Site et période de l`étude
Notre étude s’est déroulée dans les laboratoires du Centre de Génétique
Humaine de l'UNIKIN et du laboratoire de chimie et hématologie de l'UNIKIN.
Notre étude s’est déroulée durant la période allant du 1er février au 20 Juillet 2023.
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Notre population d’étude était constituée des sujets porteurs ou non du trait
drépanocytaire.
Micropipettes
Vortex ;
Thermocycleur (Marque Thermo Fischer scientific veriti);
Le Transilluminateur UV (VWR) ;
Bain-marie ;
Gants nitrile
Centrifugeuse réfrigérée ;
Nanodrop (Spectrophotomètre) ;
Tubes de centrifugation plastic conique de 50ml ;
Glace ;
Cool box;
Accumulateur de froid;
Réservoir des déchets liquides dangereux ;
Papier essuie-tout;
Centrifugeuse
Mini tube à essai support
Pipette pasteur
Bougie;
Allumette;
Tubes EDTA
Micropipettes multicanaux;
Peigne
Seringue;
Ouate ;
Moule;
Hameçon à base de pipette pasteur
Ordinateur pour le Nanodrop
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II.1.4.2. Réactifs
Tampon Red Cell Lysis (RCL)
Tampon SE (sodium EDTA)
Protéinase K
SDS 10%
NaCl 5M
Isopropanol ou éthanol à 96%
TE : Tris EDTA
Tube d’eppendorf 1,5ml
Éthanol 70%(-20°C)
Tampon pH 9.2
TBE
Gel red (Biotium TM)
Dinucléotides triphosphate (dATP. dCTP, dGTP, dTTP : marque Invitrogen)
Taq polymérase (Roche TM)
Amorces (100 mM Sens : 5’TTGGAGCCACACCCTAGGGCTG 3’ et
Anti-sens : 5’CATCAGGAGTGGACAGATCC 3’ Marque IDT);
Endonucléases (Ddel, Marque Thermo scientific) ;
Bleu de Bromophénol
Solution DNA AWAY
Tampon d’amplification Mg2+ (Roche)
Agarose Ultra-pure (Invitrogen);
Marqueur de poids moléculaire 1kb (Invitrogen)
II.2. Méthodes
II.2.1. Techniques d’échantillonnage
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Les prélèvements de sang total ont été faits sur tube EDTA sur lequel étaient
mentionnés le nom et le prénom de sujets d’étude ainsi que le numéro
d'identification du prélèvement. Les échantillons étaient conservés au réfrigérateur
dans les tubes EDTA à une température allant de 2 à 8 ºC.
Mode opératoire :
- Préparation de la membrane d’acétate de cellulose :
Remplir la moule avec le tampon de triglycine ;
Sur la surface lisse de la membrane marquer le haut par le marqueur du début
de la migration ;
Déposer la membrane en la plongeant doucement dans le bac ;
Recouvrir le bac ;
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PCR classique
La PCR est basée sur la polymérisation en chaine d’une séquence spécifique
d’ADN en suivant un pallier des températures de façon répétitive jusqu’à
l’amplification. .
3 grandes étapes définissent la PCR. :
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III.1.RESULTATS
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Phénotype AA AS SS TOTAL
Sexe
Ce tableau montre que les sujets masculins étaient prédominants avec 18 cas
analysés soit 60 % par rapport aux sujets de sexe féminin, qui étaient représentés
par 12 individus, représentant 40 % des échantillons analysés par la technique de
l’électrophorèse sur la membrane d’acétate de cellulose.
Phénotype AA AS SS TOTAL
Sexe
Ce tableau montre que les sujets masculins étaient prédominants avec 18 cas
analysés soit 60 % par rapport aux sujets de sexe féminin, qui étaient représentés
par 12 individus, représentant 40 % des échantillons analysés par la technique de
Biologie moléculaire.
Méthodes utilisées
Phénotypes
et Génotypes Electrophorèse PCR et RFLP concordance des
Résultats en %
AA 9 9 100
AS 4 4 100
SS 17 17 100
TOTAL 30 30 100
III.2. DISCUSSION
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Nos résultats concordent avec les résultats trouvés en 2020 par Thiam L., et
coll pour son étude sur la comparaison de deux techniques (PCR et électrophorèse
sur la membrane d’acétate de cellulose), ainsi que Sène AN sur le même sujet.
Ces résultats obtenus nous amènent à conclure que l’électrophorèse de
l’hémoglobine sur la membrane d’acétate de cellulose demeure valable dans le
diagnostic de la drépanocytose malgré les avancés techniques de la biologie
moléculaire (PCR-RFLP), confirmant ainsi notre hypothèse nulle énoncée au début
de notre étude.
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CONCLUSION
RECOMMANDATIONS
Mener une étude approfondie sur le même sujet avec une taille d’échantillon
supérieur à 100
Mener une étude sur les méthodes récentes dans le diagnostic de la
drépanocytose
Mener une étude en Génie génétique pour trouver les meilleurs moyens
thérapeutiques de la drépanocytose ;
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REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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d'électrophorèse d'hémoglobine dans le diagnostic d'une
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https://apps.who.int/iris/handle/10665/1727. Consulté le 12/03/2023
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