Université de Constantine III

Faculté de Médecine PR Bensmail

Département de Pharmacie
Laboratoire de Chimie Analytique
6ème Année

DEMARCHE METHODOLOGIQUE
EN ANALYSE PHARMACEUTIQUE

Constantine les 5 et 7 Mars 2013

Dr B.ACHOUR-BOUAKKAZ

I) INTRODUCTION

II) RAPPEL DES METHODES ANALYTIQUE

1) Méthodes d’analyses chimiques

2) Méthodes d’analyses instrumentales

III) CHOIX D’UNE METHODE ANALYTIQUE

III1) METHODES D’IDENTIFICATION

a) Matière première

b) Milieux biologiques

III2) METHODES DE DOSAGE

a) Matière première

b) Formes pharmaceutiques (produit fini)

c) Milieux biologiques
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I-INTRODUCTION
-La chimie analytique est une science fondamentale, elle regroupe les méthodes en analyse
chimique qualitative et quantitative.
L’analyse chimique a fait preuve de beaucoup d’innovations, avec l’automatisation des
méthodes analytiques utilisant des instruments très puissants et très performants en
sensibilité et spécificité.
Pour conseiller la meilleure méthode afin de résoudre le problème d’analyse, il existe une
science appelée chimiométrie.
La chimiométrie regroupe l’ensemble des méthodes d’exploitation (statistiques) pour
résoudre le problème posé en s’appuyant sur l’outil informatique.
Elle cherche a apporté une réponse correcte par exploitation des résultats afin de réduire
le nombre d’essais pour les analyses longues et couteuses.
La chimie analytique englobe donc l’analyse chimique et la chimiométrie.
En effet des méthodes d’analyses fiables sont requises pour assurer la conformité avec la
réglementation nationale et internationale dans tous les domaines d’analyse et celui du
domaine pharmaceutique.
Le laboratoire d’analyse doit prendre les dispositions appropriées pour s’assurer qu’il est en
mesure de fournir les données de niveau de qualité requis par l’utilisation de méthodes
validées en respectant les critères de validation.
- Répétabilité
- Reproductibilité
- Spécificité
- Linéarité
- Robustesse
- Limite de détection et de quantification

I) Rappel des méthodes analytiques :

- Méthodes chimiques d’analyse

- Méthodes instrumentales d’analyse

1) Méthodes chimiques d’analyse :

Elles sont caractérisées par leur simplicité, leur rapidité de mise en œuvre et un faible
coût du matériel. Elles sont décrites dans la pharmacopée et appliquées aussi bien pour
les matières premières que pour les formes pharmaceutiques simples. On distingue :

2
 - Méthodes protométriques
- Méthodes d’oxydoréductions
- Méthodes compléxométriques
- Méthodes par précipitations
- Méthodes de dosage par paires d’ions
Ces techniques manquent de spécificité et sont difficilement applicables aux mélanges
complexes sans extractions préalables des constituants à doser. Mais elles ont toujours
leur place parmi les méthodes actuelles des différentes pharmacopées.

a) Protométrie en milieu aqueux et non aqueux :

- Il s’agit de réactions acide/base selon la définition de Bronsted mettant en jeux des
protons d’où le nom de protométrie.
La protométrie est une méthode bien adaptée aux matières premières, et adaptable dans
certains cas au produit fini (forme pharmaceutique).
Elle reste actuellement une méthode de base pour le contrôle de la matière première dans
l’industrie pharmaceutique.
La méthode est décrite dans la pharmacopée française, dans la pharmacopée européenne et
dans d’autres pharmacopées.
On distingue deux grands types de protométrie :
- Protométrie en milieu aqueux = s’applique essentiellement aux acides et bases
minéraux (généralement forts en milieux aqueux). Peu de molécules organiques
d’intérêt pharmaceutique peuvent être dosées par ces méthodes (acide/base
organiques faibles).
Le point de fin de titrage est déterminé soit par les indicateurs colorés, soit par
potentiométrie.
- Protométrie en milieux non aqueux = met en jeux des réactions acide/base dans des
solvants autres que l’eau. Elle sera mise en œuvre quand :
 le composé à doser est insoluble dans l’eau
 la force de l’acide ou de la base est trop faible pour être dosé en milieu
aqueux.
 Mélange de polyacides ou polybases
Elle nécessite un bon choix du solvant (solvants peu toxiques et peu chers)
Exemple : le benzène permet le dosage des bases organiques mais il est peu employé à
cause de sa toxicité

b) La compléxométrie = est une des méthodes volumétriques les plus utilisées, en

particulier pour le dosage des matières premières pharmaceutiques. Elle est

3
 largement décrite dans la pharmacopée pour la détermination du titre des sels de
métaux bivalents ou trivalents soit par méthode directe, soit par retour.

- En analyse qualitative elle est utilisée pour :

 L’identification de ligands dans les essais limites des matières premières

(recherche d’impuretés).
 Comme réactions d’identification d’une matière première

- En analyse quantitative : la formation de complexes peut donner lieu à de très

nombreuses exploitations quantitatives.

 dosages compléxométriques ou compléxonométriques utilisant E.D.TA, Na2

ou complexon III dans les méthodes volumétriques pour la détermination des
sels de métaux bivalents ou trivalents, soit par méthodes direct ou par
méthodes en retour.
 Dosages spectroscopiques : lorsqu’un complexe est fortement coloré, il peut
être exploité dans un dosage colorimétrique Exemple dosage du Fer (Fe2+)
Les méthodes complexométriques sont aussi précises que la spectroscopie d’absorption
atomique S.A.A, mais beaucoup moins spécifique et sensible.
La compléxométrie est préférée parfois à la S.A.A pour des raisons de simplicité et du
coût du matériel.
c) Méthodes d’oxydoréduction = un grand nombre d’applications simples, précises et
dont la mise en œuvre est généralement peu couteuse.
Les différentes techniques couramment utilisées sont :
- La manganimétrie utilisant le pouvoir oxydant du permanganate du potassium KMnO4.
Exemples d’applications :
 Dosage des sels ferreux et sels ferriques
 Dosage de l’eau oxygénée
 Dosage des sucres réducteurs (méthode de Bertrand) très utilisée en
bromatologie

- La chromimétrie = utilisant le pouvoir oxydant du bichromate de potassium K2Cr2O7

c’est une technique connue pour le dosage de l’éthanol (Méthode de Cordebard)

- L’halogénométrie : comprend l’ensemble des méthodes qui utilisent les propriétés

oxydoréductrices des principaux halogènes (chlore, iode, brome, ) chlorométrie,
iodométrie, bromométrie

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 - Periodimétrie. Comprend l’ensemble des méthodes de dosage utilisant les propriétés
oxydantes du système oxydoréducteur I+7/ I+5

Ces techniques sont peu spécifiques, ce qui limite leur emploi au contrôle des matières
premières. En effet dans le cas d’un mélange de constituants (produit fini, milieu
biologique), il est préférable d’utiliser une méthode d’analyse plus spécifique.

2) Méthodes instrumentales d’analyse :

a) Méthodes chromatographiques : ce sont des méthodes de séparation,

d’identification, et de dosage.
Principe général : il est basé sur la répartition des substances du mélange à analyser
entre deux phases, l’une mobile et l’autre stationnaire
La phase mobile peut être :
- liquide et on parle de chromatographie en phase liquide.
- un gaz et on parle de chromatographie en phase gazeuse.
- Un fluide supercritique et on parle de chromatographie en phase supercritique.
Couplée à des systèmes de détection très puissants, la chromatographie est très
utilisée en analyse pharmaceutique :
- Matières premières
- Produits finis
- Surtout le dosage des médicaments dans les milieux biologique (sang et urine)

Les différentes techniques de chromatographie :

- La chromatographie sur couche mince (C.C.M) ou appelée aussi chromatographie

planaire. Utilisant des plaques sur laquelle est déposée la phase stationnaire en une
couche très mince.
La révélation ou la détection des substances se fait sur la plaque, il s’agit d’une
chromatographie par développement.
Chaque substance est caractérisée par son facteur de retardement ou facteur de
rétention Rf mesuré directement sur la plaque
L’identification d’une substance se fait en comparant son Rf avec le Rf d’une
substance de référence (étalon).

La C.C.M est très utilisée pour l’identification et la détermination de la pureté de

la matière première.( méthode pharmacopée)
Utilisée aussi pour la détection des médicaments dans les milieux biologiques
(toxicologie)
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 - La chromatographie en phase gazeuse C.P.G :
C’est une méthode de séparation sur colonne, utilisée pour les substances volatiles
ou volatilisables véhiculées par un gaz inerte appelé gaz vecteur.
Les applications de la C.P.G sont nombreuses. Dans le domaine pharmaceutique elle
est utilisée en analyse qualitative et quantitative

 En analyse qualitative : les grandeurs de rétention volume ou temps de

rétention sont caractéristiques d’une substance ; elles peuvent être utilisées
dans un but d’identification.
- pour vérifier la pureté de certaines matières premières.
-Séparation des médicaments d’une même famille en toxicologie.
 En analyse quantitative : l’analyse quantitative est basée sur la mesure de la
surface du pic enregistré puisqu’elle est proportionnelle à la quantité de
substance éluée.
Du fait de sa sensibilité, la C.P.G a permet le développement des dosages des
médicaments surtout dans les milieux biologiques

Plusieurs types de détecteurs peuvent être utilisés, de sensibilité et spécificité variables.

On peut citer comme détecteurs :
 L’ionisation de flamme (FID : flamme ionisation detector) le plus utilisé
 Le catharomètre
 Capture d’électrons
 Détecteur thermoïonique
Avec l’utilisation des colonnes capillaires très performantes, et le couplage avec
d’autres méthodes d’analyse comme :
 La spectrométrie de masse C.PG/Masse
 La spectrométrie Infrarouge C.P.G/IR
A permet les identifications complexes.
- La chromatographie en phase liquide = c’est la plus ancienne des méthodes
chromatographiques. ( expérience de Mickael Tswest = séparation des pigments
colorés par l’éther de pétrole utilisé comme phase mobile sur une colonne remplie de
carbonate de calcium qui constitue la phase stationnaire) d’où le nom de
chromatographie : chroma du grec signifie couleur.

Avec l’utilisation de phases stationnaires de fine granulométrie diamètre des grains

environ 3um, et les pompes puissantes. La chromatographie liquide a changé de nom est
devenu :
 Chromatographie liquide haute pression ou haute performance C.L.H.P
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 (en Français), High performance liquid chromatography H.P.L.C (en Anglais)

Les systèmes de séparation les plus courants qui sont mis en œuvre sont :
 Adsorption : la phase stationnaire est solide
 Partage classique ou mode normale : utilisant une phase stationnaire liquide
polaire et une phase mobile apolaire.
 Polarité de phase inversée ou reversed phase (R.P) : dans ce cas la phase
stationnaire liquide est apolaire et la phase mobile est polaire.
75% des séparations sont réalisées en mode inverse utilisant des colonnes R.P contenant
des phases stationnaires greffées formées de longues chaines de carbone. EX : colonne
R.P C8 et R.P C18
Les détecteurs utilisés en chromatographie liquide :

 Spectrophotomètre UV/Visible = après les détecteurs à longueur d’onde fixe (254

ou 280 nm), l’apparition sur le marché de spectrophotomètres à longueur d’onde
variable (de 190 à 700 nm) a considérablement étendu leur domaine d’application ; ils
restent cependant des détecteurs spécifiques dont la réponse dépend
essentiellement de l’absorptivité du soluté (application de la loi de Beer-Lambert)

 Spectrofluorimètre = destiné au départ aux composés fluorescents, le champ

d’application de ce détecteur s’est développé grâce aux réactions chimiques de
dérivation pré ou post colonne à l’aide de marqueurs fluorescents.

 Détecteur électrochimique = ce type de détection, qui ne s’applique qu’aux

substances oxydables ou réductibles s’est extrêmement popularisé ces dernières
années. On peut citer le dosage des catécholamines.

-La chromatographie en phase supercritique CPS : Complémentaire des

chromatographies en phase liquide et gazeuse:
 La CPG exige la volatilité et la stabilité thermique des solutés;
 L’HPLC l’absence de détecteur aussi universel et sensible que le détecteur à
ionisation de flamme
 Phase mobile(CO2):peu couteux, atoxique, ininflammable, bon pouvoir solvant, sans
odeur

-La chromatographie ionique : est l’évolution moderne de la chromatographie par

échange d’ions. Son principe est fondé sur les propriétés des résines échangeuses d’ions qui
permettent une fixation sélective des anions ou des cations présents dans une solution. La

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chromatographie ionique est considérée comme la méthode de référence en matière de
dosage des espèces ionique.
Cette méthode s’applique aussi bien aux anions qu’aux cations conjugués à des protolytes
forts mais elle est cependant, actuellement surtout utilisée pour doser les anions minéraux
difficiles à déterminer par les autres procédés chromatographiques :
Chlorures, nitrates, phosphates et sulfates en hydrologie par exemple.

b) Méthodes électrochimiques :
Les méthodes électrochimiques mettent en jeu des réactions électrochimiques, c'est-
à-dire des réactions où il existe un échange d’électrons entre un conducteur ionique (la
solution) et un conducteur électronique (une électrode).
Les méthodes électrochimiques sont utilisées pour le contrôle de la matière première
(protométrie en milieu aqueux et non aqueux) et dans les mesures précises de pH.
La mesure du pH : paramètre très important qui caractérise la pureté d’une
substance, une valeur anormale du pH est l’indice de la présence d’une impureté.
On distingue :
 les méthodes indicatrices =
- Polarographie
- Ampérométrie
- Potentiométrie
- Coulométrie

 Les électrodes sélectives = elles permettent la mesure d’une espèce dans un mélange
sans préparation. La détection peut être ampérométrique ou potentiométrique
c) Méthodes instrumentales spectrales : de nombreuses méthodes analytiques sont
fondées sur les interactions entre la matière et une radiation électromagnétique. Le
phénomène exploité en analyse d’atomes ou de molécules, est l’absorption de la
radiation ou la restitution sous forme de lumière de l’énergie absorbée.
Les mesures sont réalisées aussi bien sur un liquide que sur un solide (spectrométrie
d’absorption ou d’émission moléculaire) ou sur une vapeur atomique produite dans une
flamme ou dans un four (spectrométrie d’absorption ou d’émission atomique).

-Spectrophotométrie UV/VISIBLE :
-Son domaine spectral est compris entre 50 à 800nm
Zone comprise entre 50 à 200nm (UV lointain) ce domaine n’est pas utilisé en pratique car
l’énergie est trop importante.
Zone comprise entre 200 à 400nm (UV proche). L’énergie reste élevée, on observe soit
des transitions électroniques, soit des réactions photochimiques.
Zone comprise entre 400 à 800nm (visible).
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 La Spectrophotométrie UV/VISIBLE est utilisée en analyse qualitative et quantitative
 Application qualitative : identification d’une matière première par la détermination
de l’absorbance spécifique d’une substance.
Elle n’est pas parfaite comme méthode d’identification

 Application quantitative = dosage basé sur la loi de Beer- Lambert qui relie
l’absorbance à la concentration de la substance à doser à une longueur d’onde donné

Utilisation de la technique UV/VISIBLE comme détecteur après séparation par

chromatographie liquide H.P.L.C
 H.P.L.C/UV/Visible classique
 H.P.L.C/UV/Visible à barrettes de diodes H.P.L.C/D.AD qui est la plus utilisée
actuellement en raison de sa puissance de détection. Toutes les longueurs d’ondes de
200 à 800 nm peuvent être analysées simultanément en quelques secondes.
Nouvelles applications de la spectroscopie UV/VISIBLE
- Analyse multi composants
- Spectrométrie dérivée

-Spectrophotométrie Infrarouge :
On distingue habituellement trois régions:
L’infrarouge lointain, allant approximativement de 420 à 20 cm-1
L’infrarouge moyen, allant approximativement de 4300 à 420 cm-1
Le proche infrarouge plus énergétique allant approximativement de 12800 à 4300 cm-1
La Spectrophotométrie infrarouge est inscrite à la pharmacopée,
Les applications de l’infrarouge sont quotidiennes dans les laboratoires de recherche qui
doivent identifier des substances organiques de synthèse. C’est une méthode intéressante
qui s’ajoute à l’UV, la R.M.N et la spectrométrie de masse.
En analyse qualitative elle permet l’identification des matières premières ou d’un toxique
Elle est basée sur la comparaison du spectre de la substance avec celui décrit dans les
tables de spectre.
Les appareils récents comportent en mémoires une bibliothèque de spectre de produits les
plus courants et la comparaison entre la substance et le produit étalon est réalisée sur
écran cathodique.
De nouveaux développements de la technologie dans le domaine de l’industrie
pharmaceutique permettent d’augmenter considérablement le rôle de l’infrarouge pour
l’identification des matières premières.
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- Spectrophotométrie d’émission atomique S.E.A = photométrie de flamme

S.A.A flamme
- Spectrophotométrie d’absorption atomique S.A.A
S.A.A four
Ces méthodes sont basées sur l’exploitation des spectres de raies émis par les atomes
ayant subi une excitation suffisamment énergétique pour obtenir une variation de l’énergie
des électrons et essentiellement de ceux qui se trouvent sur les couches les plus
extérieures (électrons de valence).
La S.E.A, qui s’intéresse aux atomes à l’état E1 sera utilisée pour doser les alcalins dans
une flamme qui n’a pas besoin d’être très énergique.
La S.A.A, qui concerne les atomes à l’état E0, sera de portée plus générale. Elle permet
de doser tous les éléments dont la radiation de résonance λ > 180 nm
Ces méthodes intéressent de nombreux domaines : l’industrie chimique pharmaceutique et
l’agro-alimentaire ainsi que la biologie. Les dosages sont donc réalisés dans différentes
matrices, ce qui nécessite une mise au point adaptée à chaque cas.

-La Spectrophotométrie d’émission plasma

Les plasmas sont des gaz plus ou moins ionisé : G G+ + e-

Ils sont créés et entretenus par apport d’énergie à un gaz dit plasmagène au moyen d’un
générateur. Ce gaz est en général de l’argon. Les échantillons à analyser sont introduits
dans le plasma par l’intermédiaire d’une torche (torche plasma) I.C.P (inductively coupled
plasma) et sont transformés en vapeur atomique ou éventuellement ionique et excités par
les constituants du plasma : G, G+, e-
Les températures atteintes dans le plasma sont élevées : de l’ordre de 4500K° à 8000K°
II) Choix d’une méthode analytique :
Le dosage et l’identification de toute molécule médicamenteuse font appel à des
procédés analytiques très divers dont le choix n’est pas toujours facile. Il ya donc lieu
avant de mettre au point ou d’adapter une technique analytique plus ou moins complexe et
onéreuse en temps et en matériel, de bien positionner le problème à résoudre.
S’agit-il d’un contrôle pharmaceutique ?
- Matière première ou produit fini
- D’un dosage de médicament dans un milieu biologique (sang, urine etc…)
En effet la méthode sera fonction de :

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 1) De la composition du milieu (matrice)
 Dans une matière première le principe actif est le constituant essentiel
 Dans une forme pharmaceutique ou produit fini (comprimé, suppositoire, ou
autres). Le ou les principes actifs coexistent avec des excipients et des
conservateurs.
 Dans les milieux biologiques la matrice est plus complexe, dans ce cas le
principe actif doit être séparé d’abord des protéines est des autres
composés endogène, d’où la nécessité d’un prétraitement de l’échantillon

2) Des caractéristiques des méthodes analytiques :

Certaines méthodes sont plus ou moins sensibles ou spécifiques
 Ainsi les méthodes titrimétriques ou spectrophotométriques seront utilisables
sur des milieux limpides en l’absence d’interférences importantes.
 A l’inverse, les méthodes chromatographiques (méthodes séparatives) seront
utilisables lorsqu’il ya lieu de séparer le principe actif P.A des substances
endogènes ou d’autres molécules à propriétés voisines.

3) Des caractéristiques de la molécule

 Les caractères organoleptiques (aspect, couleur, odeur) de la molécule

permettront dans certains cas simples son identification.
 Les caractères physicochimiques tels que le point de fusion, le pouvoir
rotatoire, les longueurs d’onde d’absorption UV ou IR peuvent aider à
l’identification d’une substance.
 Le caractère acide /base, la volatilité, la solubilité, la stabilité, la polarité
permettent de mettre au point l’extraction et le dosage de la molécule
 Connaître les caractéristiques pharmacocinétiques de la molécule va nous
permettre de mettre au point son dosage dans liquides biologiques. En effet
selon les médicaments, les concentrations dans le plasma, les urines, les tissus
sont très variables.

III1) les méthodes d’identification

a) Matière première :
- la première série d’opérations de contrôle consiste à vérifier
 L’identité de la matière première réceptionnée
 L’examen des caractères organoleptiques qui sont définis par la pharmacopée

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- Ensuite en fonction de la matière première il faudra choisir une ou plusieurs des
techniques suivantes basées sur la détermination d’une constante physique ou d’une
propriété chimique tel que :
 Le point de fusion = la température de fusion d’une espèce chimique est une
constante caractéristique de chaque composé dont la détermination permet
de vérifier l’absence d’impuretés

 Le pouvoir rotatoire : c’est la propriété que représente certaines substances

de dévier le plan de polarisation de la lumière polarisée en utilisant un
polarimètre la pharmacopée définit l’angle de rotation optique, le pouvoir
rotatoire spécifique d’un liquide, d’une substance ou d’une solution. Le pouvoir
rotatoire est particulièrement intéressant pour l’identification des acides
aminés, des sucres, des composés à carbone asymétrique

 L’indice de réfraction : mesuré à l’aide d’un réfractomètre, il permet

l’identification des huiles et de nombreux liquides purs.

 La densité relative : mesurée grâce à un pycnomètre à solide ou à liquide.

 Les indices chimiques : comme l’indice d’acide, de peroxyde.

- Enfin, deux groupes de méthodes sont facilement réalisables pour l’identification d’une
matière première mais nécessitent un échantillon pur comme étalon
 Méthodes spectrales :
En UV/Visible = détermination du maximum d’absorption qui doit
correspondre à la longueur d’onde indiqué dans la monographie de la
pharmacopée.
En IR on doit vérifier la superposition des bandes du spectre de la substance
à analyser et d’une substance de référence
L’IR ne peut pas servir de critère de pureté mais c’est une méthode
d’identification rapide et fiable

 Méthodes chromatographiques :
La C.C.M est une méthode spécifique et trés sensible largement utilisée pour
l’identification des molécules (comparaison des Rf substance et étalon)

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 -A côté de ces techniques physiques d’identification des matières premières, la
pharmacopée décrit des réactions d’identité des ions et des groupements fonctionnels. Le
principal inconvénient réside en la préparation des nombreux réactifs nécessaires et en la
complexité de certaines réactions.
Il existe différents documents couramment utilisés pour connaître les caractères
Physico-chimiques d’une matière première, on peut citer :
- Les pharmacopées françaises et européennes
- L’index Merck
- Les fiches SFSTP (société Française des sciences et techniques pharmaceutiques)
- Les fiches techniques et les dossiers techniques fournis par les laboratoires
fabricants.

Critères de pureté d’une matière première

Après l’identification de la matière première, il est nécessaire de s’assurer que
celle-ci n’est pas contaminée (résidus de synthèse en cas de purification
insuffisante, produit de dégradation en cas de mauvaise conservation).
Des méthodes plus ou moins spécifiques sont utilisables :

 C.CM : un corps pur ne donne qu’une seule tâche après révélation. Cette
méthode très facile à mettre en œuvre, permet la mise en évidence
d’impuretés ou de produits de dégradation.

 Spectrophotométrie UV le coefficient d’absorbance spécifique est

caractéristique de la substance dans un solvant déterminé. On se place à la
longueur d’onde maximale d’absorption. L’absorption mesurée doit être
comprise entre deux limites définies par la monographie ou la fiche technique
de la matière première.

 Perte de masse par dessiccation : cet essai permet de connaitre le degré

d’hydratation. C’est un critère important à connaitre puisque la présence
d’eau abaisse le titre de la matière première. Elle peut être déterminée par
différentes méthodes selon les indications de chaque monographie.

 Essai limites des métaux lourds : recherche des métaux lourds en fonction
de chaque matière première. Chaque monographie indiquera le procédé à
utiliser.

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  Recherche d’impuretés particulières : certaines impuretés particulières à
chaque matière première peuvent être recherchées. Une impureté de
fabrication, de dégradation.
b) Médicaments dans les liquides biologiques : dépistage toxicologique
L’identification des médicaments dans les liquides biologiques après intoxication aigué
est souvent complexe en effet la gamme des médicaments à identifier est vaste.
Les réactions d’identification doivent être spécifiques des médicaments et non des
substances endogènes. Les concentrations peuvent être inférieures au seuil de détection.
Dans la pratique le médicament est recherché dans le liquide de lavage gastrique, le plasma
et les urines. Mais c’est dans le liquide de lavage qu’il sera plus facile d’identifier un
médicament et ce d’autant que le médicament subit des biotransformations importantes.
Les méthodes utilisées sont :

 Identification par réactions colorés: ces réactions sont spécifiques d’un

groupement chimique, elles s’effectuent directement sur le liquide de lavage
gastrique ou l’urine.

 Identification après séparation : c’est la méthode la plus employée

Elle consiste à identifier les médicaments après séparation par
chromatographie sur couche mince C.C.M

 Identification par les méthodes immunologiques : ces méthodes développées

pour le dosage des médicaments ont été appliquées aux recherches
toxicologiques

 Dans certains cas difficiles, on fait appel à d’autres méthodes comme la

spectrométrie de masse couplée à la C.P.G ou à L’ H.P.L.C

III2 Les méthodes de dosage

On définit les critères analytiques fondamentaux des techniques de dosage dans les trois
milieux : matière première, produit fini, milieux biologiques
 Pour les matières premières : le point fondamental est la précision : une pureté doit
pouvoir être déterminée à 0,1% prés.

 Pour les formes pharmaceutiques : le titre du P.A doit pouvoir être assuré à ± 5%
selon la législation européenne en vigueur, sinon il conviendra de justifier un
dépassement de ces normes
Le point le plus important est la spécificité (interférences des excipients) ainsi que la
sensibilité dans certains cas.
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  Pour les milieux biologiques : les deux critères essentiels sont la sensibilité et la
spécificité, la précision de la méthode étant acceptable jusqu’à 10% environ

a) Matière première
1) Dosage des éléments minéraux
1,1) Cations
 Les alcalins : Na, K, Li, Ce, Fr, Rb
Ce sont des métaux qui, combinés à l’oxygène, forment des alcalis.
Leur potentiel d’ionisation relativement bas, permet de les doser facilement par
spectrophotométrie d’émission atomique (S.A.E) encore appelée photométrie de
flamme
C’est la méthode la plus simple et la plus spécifique (utilisation de la raie de
résonance de l’élément à doser).
 Les alcalino-terreux : Ba, Mg, Ca, Sr, Rd
Leur potentiel d’ionisation plus élevé que les alcalins ne permet pratiquement pas
d’utiliser la S.A.E, c’est pourquoi on utilise la spectrophotométrie d’absorption
atomique (S.A.A) en raison de sa précision et de sa spécificité.
On utilise aussi les méthodes compléxométriques qui sont aussi précises que la
S.A.A, mais beaucoup moins spécifiques et sensibles.
La compléxométrie nécessite une bonne maîtrise de l’appréciation du virage et le
contrôle du PH en utilisant des solutions tampons.
Le dosage peut être direct ou en retour.
 Les métaux de transition et certains non métaux
Ils correspondent dans le domaine médical aux oligoéléments et certains minéraux
(métaux lourds) Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Ag, Cd, Sn, Bi, Pb, leur détermination se
fait sélectivement par absorption atomique (S.A.A)
Il ne faut pas oublier que la S.A.A dose l’élément et non pas l’état d’ionisation
possible de l’élément (Fe2+ et Fe3+ ne peuvent être distingués). Il faudra utiliser
d’autres méthodes comme (polarographie, électrode spécifique) pour obtenir une
information plus précise sur l’état de valence.
Une autre alternative pour les éléments de transition est la titrimétrie soit par
formation de chélate (compléxométrie), soit par oxydoréduction chimique ou
électrochimique.

1,2) Anions :
Dans les pharmacopées le dosage d’un sel minéral est soit le dosage du cation, soit le
dosage de l’anion.

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  les halogénures (F-, Cl-, Br-, I-)
Pour le dosage de ces anions, on utilise comme techniques :
 l’argentimétrie
-Argentimétrie directe : Cl- , Br- , I- ont des produits de solubilité suffisamment faible
sous forme de sels d’argent pour être dosés par argentimétrie directe en utilisant le
nitrate d’argent 0,1N comme réactif titrant et en utilisant une détection potentiométrique
en utilisant une électrode d’argent.
-Technique de Mohr en milieu neutre pour les chlorures Cl-
-Technique de Charpentier-Vohlard en milieu acide
Les méthodes de Charpentier- Vohlard et Mohr permettent de doser en principe
n’importe quel anion chlorure dans n’importe quel matière première. La simplicité de la
méthode de Mohr en fait la méthode de choix alors qu’elle n’est pas toujours utilisable
pour les formes pharmaceutiques (pH acide). Dans ce cas il faudra avoir recours à la
technique de charpentier Volhard.

 Dosage par électrode spécifique : dans le cas des halogénures on utilise tout
particulièrement l’électrode spécifique à fluorure pour les préparations
pharmaceutiques et les milieux biologiques.

 Méthodes compléxométriques : avec le nitrate de thorium pour le dosage des

fluorures F-
C’est la méthode de choix pour le dosage des sels fluorés : simple, rapide, spécifique

 Méthodes d’oxydoréduction = simple et précise, mais comme toutes les techniques

d’oxydoréduction, sa spécificité est très mauvaise (interférences des autres couples
dans le dosage).

1,3) Les anions complexes :

On définira les anions complexes par la combinaison de deux éléments chargés
négativement : SO42-, NO2-, NO3-, CN-, PO43-
Il est rare, en fait que ces anions soient dosés lors du contrôle d’une matière première.
On préfère déterminer le cation correspondant (sodium, potassium) dont le dosage est
souvent plus simple et plus précis
2) Dosage des molécules organiques :
Les substances organiques peuvent être définies comme des combinaisons moléculaires
formées des atomes de C, H, N, S, O et éventuellement d’autres éléments. Il peut s’agir
d’acides, de bases, de molécules sans pK, de sels.

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Pour doser une molécule organique en tant que matière première, l’analyste doit
sélectionner dans la molécule considérée un groupement fonctionnel susceptible d’être mis
en jeu dans une méthode de dosage rapide, simple, très précise.
2,1) Acides

 L’acidimétrie en milieux aqueux : les acides organiques suffisamment forts pour être
dosés directement ou en retour en milieu aqueux sont relativement peu nombreux en
pharmacie.
 l’acidimétrie en milieu non aqueux : l’utilisation d’un solvant non aqueux permettant
une meilleure dissolution du principe actif, Exemple Acétone, éthanol préalablement
neutralisés.
Dans ce cas le réactif titrant est une solution alcoolique ex : KOH alcoolique 0,5N

2,2) Bases

 Dosage en milieu aqueux : réservé aux bases fortes

 Dosage en milieu non aqueux : réservé aux bases faibles on peut citer comme
exemple la méthode classique de Pifer et Wollish développée dans les années
1950 ; sa simplicité, sa rapidité, sa très grande précision l’on fait adopter de
façon universelle et elle figure dans de très nombreuses pharmacopées.
Le principe de la méthode est le suivant : la basicité de la molécule à doser est
exaltée par dissolution dans l’acide acétique ; ce dernier par solvatation va libérer un
ion acétate qui va pouvoir être dosé par un acide fort comme HClO4 0,1N. Il s’agit
d’un dosage indirect.

2,3) Les molécules carbonylées : Aldéhydes et cétones peuvent réagir de façon

quantitative avec l’hydroxylamine

R – C = O + H2NOH R – C = N - OH + H2O
C’est une technique volumétrique simple applicable à de nombreux composés
carbonylés ne possédant pas d’autres fonctions organiques caractéristiques.

2,4) Les polyols simples : sucres, dérivés du glycérol etc………..

La méthode de choix c’est la périodimétrie : elle est précise, simple, reproductible,

elle figure dans de très nombreuses monographies de la pharmacopée.

Lorsque la périodimétrie n’est pas utilisable, il reste deux solutions :

- Soit exploiter le pouvoir réducteur d’un aldose ou d’un cétose (réduction de la liqueur
de Fehling)
- Soit déterminer le titre par polarimétrie pour les sucres possédant un pouvoir
rotatoire spécifique.
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 2,5) Les molécules oxydoréductibles :
Manque de spécificité des techniques d’oxydoréduction. Ce type de dosage est pratiqué
que s’il n’ya pas d’autres méthodes disponibles.
2,6) Molécules comportant des groupements fonctionnels basiques et acides.

Le meilleur exemple est l’acide aminé

 Dosage de la fonction acide : c’est la méthode de Sorensen par formol-
titration
 Dosage de la fonction basique : dosage en milieu non aqueux

2,7) Dosage des sels de molécules organiques :

Beaucoup de médicaments organiques sont salifiés pour faciliter la dissolution du
principe actif en milieu aqueux

 Dosage des sels de bases organiques : les principaux sels de bases utilisées en
pharmacie sont :
Les chlorhydrates, les bromhydrates, les sulfates, les mésylates
Le dosage se fait par protométrie en milieu non aqueux

 Dosage des sels d’acides organiques : ex acétate de Zinc, gluconate de sodium

dosage du cation correspondant par compléxométrie ou par absorption
atomique S.A.A pour cation ( bi ou trivalent), quand le cation est monovalent il
peut être dosé par photométrie de flamme.
On peut aussi doser l’anion par protométrie en milieu acétique par l’acide
perchlorique 0,1N

3) Les formes pharmaceutiques : Dosage des minéraux dans les médicaments

1) Cations : les méthodes évoquées pour les matières premières (photométrie de

flamme, absorption atomique, colorimétrie, oxydoréductimétrie…) sont
globalement applicables aux formes pharmaceutiques

1,1) Association minérales strictes, ex oligoéléments et certains solutés massifs

Le dosage se fait par :

 Compléxonométrie : lorsque les circonstances le permettent (forte concentrations,

un seul cation à doser) les techniques titrimétriques deviennent intéressantes en
raison de leur simplicité et de leur faible coût.

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  Dosage spectrophotométrique : Formation de complexes colorés

 Émission ou absorption atomique : lorsque l’analyste doit résoudre le problème de

dosage multiéléments dans une préparation pharmaceutique, il se tournera vers une
méthode physique d’émission (photométrie de flamme) pour les alcalins et
d’absorption atomique (S.A.A) pour les autres éléments.
 L’émission atomique par plasma induit ICP = (inductive coupled plasma)

1,2) Association avec des molécules organiques = ces associations posent moins de
problèmes qu’un mélange complexe strictement poly ionique.

2) Anions
Les méthodes volumétriques sont très pratiquées à partir du moment où une seule
espèce anionique est en cause.

 Les électrodes spécifiques : peuvent être utiles (F-, CN-, SCN-, NO2-, NO3-) mais
nécessite un entretien très rigoureux

 Les méthodes d’oxydoréduction sont d’un emploi limité du fait de leur manque de
spécificité. Sont utilisées dans les dosages classiques des solutés d’hypochlorite
(Dakin, l’eau de javel)

 La chromatographique ionique : tous les anions ainsi que les anions complexes peuvent
dans certaines conditions être dosés simultanément par cette méthode
La colonne utilisée est une résine échangeuse d’anions

3) Dosage des molécules organiques

C’est le problème le plus couramment rencontré lors du contrôle du produit fini, la grande
majorité des médicaments relevant de la chimie organique.
L’analyste est appelé à développer une méthode parfaitement spécifique du produit à
doser toutes les interférences avec d’autres principe actifs associés, excipients doivent
être évitées, ceci n’est pas toujours réalisable et seules les méthodes chromatographiques
permettent d’atteindre ce but.
3,1) Les médicaments acides = les techniques qui sont utilisées sont :
 La protométrie ne peut être utilisée qu’en milieu neutre ou quand le PH n’est
pas ajusté pour une raison de stabilité des principes actifs.
 Absorptiométrie dans l’UV.
 La chromatographie en phase gazeuse (C.P.G)
 La chromatographie en phase liquide (H.P.L.C)
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 3,2) Les médicaments basiques =
Ce groupe constitue la majorité des médicaments (sous forme de base et de sel de base).
Les médicaments basiques (et leur sels) peuvent être titrés plus commodément par trois
groupes de méthodes :
 Volumétrie en phase hétérogène avec appariement de paire d’ions
 Absorptiométrie directe dans l’UV
 Méthode chromatographique : C.P.G ou plus souvent H.P.L.C

3,3) Les polyols (sucre)

Ils peuvent être dosés :
 Par voies enzymatiques (glucose)
 Par périodimétrie
 Par H.P.L.C- réfractométrie et polarimétrie

4) Liquide biologique
Le dosage des médicaments dans les milieux biologiques est le plus complexe, puisqu’il
faut séparer le médicament à doser des substances endogènes susceptibles d’interférer et
éventuellement de métabolites.
Les principaux facteurs à prendre en compte sont bien sûr la spécificité et la sensibilité
de la méthode.
Les méthodes utilisées à l’heure actuelle pour le dosage des médicaments sont de deux
types :

 Méthodes immunologiques : immunoenzymologie et immunofluorescence

 Méthodes chromatographiques : La C.C.M se prête difficilement à des réactions de

quantification, mais possible par HPTLC (CCM à haute performance) .
La C.P.G et l’H.P.L.C s’appliquent au dosage de très nombreux médicaments ainsi qu’à
leurs métabolites. La sélection entre C.P.G et H.P.L.C se fera en premier lieu en
fonction des caractéristiques physicochimique de la molécule à doser.

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BIBILIOGRAPHIE

1) Analyse pratique du médicament D. Pradeau

2) Chimie analytique et équilibres ionique Jean-Louis Burgot

3) Méthodes de séparation (tome 2) M. Hamon

4) Chimie des solutions (tome 1) M.Hamon

5) Pharmacopée Européenne 6ème Edition

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