1.

Etude toxicologique In vivo

1.1. Données générales

1.1.1. Données physico-chimiques sur la substance à tester

Il est nécessaire qu’avant toute étude toxicologique on puisse disposer du maximum de

renseignements caractérisant au plan physico-chimique la substance à étudier: identification
de la substance, composition de l’échantillon à tester, nature et teneur des impuretés,
solubilité, …etc. Ces renseignements:

- permettent de définir les conditions de manipulation et de stockage de la substance,

- Permettent de définir certaines modalités expérimentales notamment la voie

d’administration ou le mode d’administration,

- contribuent à apporter une explication pour l’apparition de certains phénomènes

toxiques,

- et enfin, permettent de s’assurer que la substance à tester a bien toujours la même

caractéristique.

1.1.2. Choix des espèces

En toxicologie, il faut se garder du jeu de la similitude entre espèces. En effet, suivant le type
d’effet toxicologique recherché, la souris, le rat, le cobaye, le lapin, le chien, le singe ou
d’autres espèces seront l’espèce qui se rapprochera le plus de l’homme. Le choix de l’espèce a
longtemps tenu compte des éléments suivants: la disponibilité sur le marché, la simplicité de
manipulation des animaux, les conditions d’hébergement, la facilité de l’élevage, la
croissance pondérale rapide…etc.

C’est ainsi que pour les études par voies orale, percutanée et par inhalation, les rongeurs et
plus particulièrement les rats sont retenus. Pour les études impliquant la peau, le lapin est
souvent utilisé. Pour les études de toxicologie chronique, le choix pour une espèce non
rongeur se porte en général sur le chien ou les primates. Pour les études de cancérogenèse, la
souris est le rat sont couramment utilisés mais également l’hamster.

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1.1.3. Choix des groupes

Le plus généralement, les groupes expérimentaux comprennent pour les toxicités chroniques
3 groupes traités et un groupe témoin. Ces groupes sont formés à partir de lots d’animaux de
la même origine le plus généralement des deux sexes, d’âge et de poids comparables.

La répartition suivant les groupes se fait le plus souvent par randomisation. Dans le cas des
études de longue durée: un an (non rongeurs), 18 mois (rongeurs), et des études
cancérogenèse, deux groupes témoins sont généralement utilisés afin d’avoir un meilleur
point de comparaison au niveau de l’analyse statistique.

1.1.4. Choix de la voie d’administration

La plupart des études qui sont entreprises dans le domaine de la sécurité des aliments sont
conduites par voie orale. Dans ce cas, le produit peut être administré soit à l’aide d’une sonde
œsophagienne ou stomacale, soit en mélange dans la nourriture ou l’eau de boisson des
animaux. Le premier mode est le plus couramment utilisé pour les études de courte durée, le
deuxième pour les études de long terme.

Citons d’autres voies d’administration possibles qui sont d’un bien moindre intérêt en
toxicologie: voies parentérales (voie I.V, I.M, voie percutanée et voie par inhalation).

1.1.5. Choix des doses

Le choix des doses varie en fonction de l’étude toxicologique à réaliser. L’étude de toxicité
aigue nécessite l’usage de fortes doses de substance permettant d’obtenir une intoxication
chez l’animal et autorisant, avec les réserves d’usage, l’extrapolation à l’homme en cas
d’’absorption massive volontaire ou accidentelle.

Pour les études de toxicité chronique, il est choisi le plus généralement une gamme de doses.
La plus faible dose correspond à la dose d’utilisation chez l’homme ou à un faible multiple de
celle-ci. La forte dose doit révéler chez l’espèce considérée des effets toxiques. la
comparaison des doses et des effets observés doit permettre d’établir des courbes doses/effets
ou concentrations/effets. Si une telle relation existe, la relation avec le traitement peut être
affirmée avec plus de certitude.

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1.1.6. Durée de traitement

En fonction d’un certain nombre de critères, les effets attendus peuvent apparaitre rapidement
ou avec une certaine latence dans le temps. Cette durée dépend également de l’espèce animale
choisie et de sa longévité. Ce sont les raisons pour lesquelles la durée des études peut varier
énormément. Le plus généralement, ces études sont réalisées de façon séquentielle; elles
débutent par des courtes durées (2 à 4 semaines), se poursuivent ensuite par des études de 3 à
6 mois, et dans le cas particulier d’utilisation longue d’une substance, peuvent aboutir à des
études de 18 mois à 2 ans, voir plus chez les rongeurs, et de12 mois ou plus chez les non-
rongeurs.

La fréquence d’administration peut être continue ou discontinue en fonction du rythme des

administrations ou de son utilisation chez l’homme.

1.2. Notion de dose journalière admissible (DJA)

Pour une substance faisant l’objet de plusieurs essais « in vivo », on obtiendra plusieurs doses
sans effet suivant l’espèce sur laquelle ils auront été faits. On choisit alors, en général,
l’espèce la plus sensible, donc qui a la dose sans effet la plus basse pour obtenir la dose
journalière admissible ou DJA (ADI-acceptable Daily intake-). Le plus souvent on divise la
dose sans effet par un facteur arbitraire qui tient compte de considérations variées telles que la
sensibilité de l’homme par rapport à celle des espèces animales…Le plus généralement, le
facteur utilisé va de 100 à 1000.

Les tests « in vivo » ne sont pas les seuls qui doivent être réalisés pour l’évaluation des effets
toxiques d’une substance. De nombreux autres aspects pharmaco-toxicologiques doivent être
abordés pour déceler un impact éventuel, par exemple: effets sur le SNC, effets sur le SCV,
effets sur le système pulmonaire….etc. Les tests « in vivo » ne permettent pas d’aborder tous
les problèmes; les tests « in vitro » doivent être conduits.

3
1.3. Toxicité aigue

1. 3.1. Principe

La toxicité aigue d’une substance a été définie comme « les effets adverses survenant dans
un court laps de temps après administration d’une dose unique ou de multiples doses réparties
sur 24 heures».L’étude de toxicité aigue permet :

- de calculer une dose ou une concentration létale qui entraine la mort de 50% des
animaux,
- de définir la nature des effets toxiques observés en établissant une relation directe
entre leur intensité et la dose ou la concentration administrée,
- de prévoir, du moins de donner des informations sur les risques encourus par l’homme
après administration ou exposition à une très forte dose,
- Enfin, de donner des indications sur la manière de conduire les études toxicologiques
de plus longues durées.

1. 3.2. Méthode
Des groupes homogènes d’animaux reçoivent la substance à tester sous la forme de doses de
concentration croissantes afin de déterminer par un calcul mathématique celle qui entraîne la
mort de 50% des animaux (DL50 et CL50). La voie d’administration préférentielle est bien
entendu dans le cas qui nous intéresse, la voie orale. La voie percutanée et la voie respiratoire
peuvent également être utilisées. La durée de la période d’observation des animaux est le plus
généralement est de 14 jours. Les espèces sur lesquelles les études de toxicité aigue sont
pratiquées sont la souris et le rat, plus rarement le lapin.

Au cours de l’essai de toxicité aigue, on note:

- Les symptômes d’intoxications, la mortalité et les lésions des organes observées lors
de l’examen macroscopique pratiqué lors de l’autopsie.
- toutes les informations recueillies sont classées par groupes de dose et par sexe.

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1.4. Toxicité subaigüe (ou subchronique)

1.4. 1. Principe

La toxicité subaigüe est la mise en évidence d’effets toxiques après l’administration répétée
quotidienne ou fréquente d’une ou de plusieurs doses de la substance à tester. La durée
n’excède pas 90 jours. Elle apporte:

- des informations sur les effets toxiques principaux d’une substance et les organes
cibles concernés,

- des précisions sur la réversibilité ou l’irréversibilité des effets précisant si ceux-ci sont
cumulatifs ou retardés,

- enfin, des précisions sur le choix des doses qui pourraient être utilisées lors des études
à plus long terme.

1.4. 2. Méthode

La toxicité subaigüe consiste en l’administration quotidienne ou fréquente de diverses doses

ou concentrations d’une substance à tester. Les espèces choisies le plus généralement sont
parmi les rongeurs: le rat et la souris, et chez les non-rongeurs, le chien ou les Primates. La
durée des études s’étend le plus souvent de 14 jours à 3 mois. L’espèce est le plus souvent
choisie en fonction des résultats d’études préliminaires et d’informations sur le métabolisme
animal. Au cours de l’étude, les animaux en expérience sont observés attentivement afin de
mettre en évidence les effets toxiques potentiels de la substance testée:

- observation clinique (état général, comportement…)

- évaluation de la croissance pondérale, de la consommation de la nourriture et de

boisson,

- examens hématologiques, tests de coagulation,

- examens biochimiques sanguins, urinaires et des fèces,

- examens fonctionnels.

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Les animaux qui meurent au cours de l’étude et ceux qui sont sacrifiés au terme de celle-ci
sont autopsiés. Les organes sont prélevés et pesés puis un examen histologique est réalisé sur
les organes et tissus prévus au protocole.

1.5. Toxicité chronique

1.5. 1. Principe

La toxicité chronique est la mise en évidence d’effets toxiques après l’administration ou

l’application répétée quotidienne ou fréquente d’une ou plusieurs doses de la substance à
tester pendant une période de temps longue, supérieure de 90 jours. Cette durée peut aller
jusqu’à 18 mois pour les rongeurs et jusqu’à 12 à 24 mois voire plus, chez les non rongeurs.
Les études permettent de mettre en évidence certaines atteintes cardiaques ou rénales car leur
apparition est le plus souvent liée à l’âge des animaux en expérience.

Les résultats de ces études doivent permettre de déterminer:

- Le type et nature des effets toxiques (fonctions atteintes, organes cibles…),

- Une dose sans effet toxique désignée comme dose seuil, une dose avec effet toxique,
- Le temps d’apparition des effets toxiques (en fonction de la dose ou de la
concentration),
- La réversibilité éventuelle des effets notés.

1.5. 2. Méthode
La substance à tester est administrée ou appliquée de manière réitérée à des groupes de
mammifères (rongeurs et/ou non rongeurs) à des doses variables. En raison de la durée de
l’expérience, le nombre d’animaux utilisés varie de 20/groupe et par sexe à plus de 35 chez
les rongeurs, de 4/groupe et par sexe à 7 ou 10 pour les non rongeurs. Les plus généralement,
3 groupes traités et un groupe témoin sont utilisés. Le choix des doses ou des concentrations
se fait en fonction des résultats obtenus lors des études de plus courte durée. La voie
d’administration est déterminée par le mode d’exposition chez l’homme de la substance;
celle-ci est le plus souvent orale dans le cas qui nous concerne.
Comme pour l’étude de toxicité subaigüe, l’ensemble des animaux d’une étude chronique fait
l’objet de nombreux examens ou mesures. Assez souvent, un certain nombre d’animaux de
tous les groupes sont sacrifiés au cours de l’étude afin de pouvoir déceler le moment de

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l’apparition de lésions histo-pathologiques et tester leur évolution dans le temps. Ces essais
sont conduits pour déterminer un niveau de dose sans effet qui sert de base à la fixation
d’une dose journalière admissible chez l’homme, les limites de tolérance des substances dans
la nourritures et l’eau de boisson, ou les valeurs limites d’exposition.

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1.6. Mutagénicité et cancérogénicité
Il est vrai qu’une mutation brutale et rapide d’une cellule sous l’influence d’un dérivé
chimique donné révèle souvent une potentialité cancérogène: tous les dérivés cancérogènes
connus sont mutagènes pour la cellule; l’inverse n’est pas toujours vrai. A l’heure actuelle, il
semble établir que 3000 dérivés mutagènes sont cancérogènes.
Un effet mutagène se traduit par une modification de l’unité génétique de l’ADN, le gène,
modification correspondant souvent à un réarrangement moléculaire. Les modalités qui
règlent les relations mutagènes-cancérogènes sont nombreuses et complexes selon les produits
et selon les testes utilisés; nous ne donnerons que quelques exemples: les agents alkylants, les
amines aromatiques et les amides, les dérivés nitroaromatiques, les hydrocarbures
polycycliques…etc.

 Les divers tests de mutagénicité

On peut classer les principaux tests utilisés en quatre catégories:
1- Tests de mutagénicité sur bactéries: les tests qui proposent de démontrer des mutations
ponctuelles (changement des paires de bases ou détermination de décalage de lecture) sur
bactéries; à cet effet on utilise des bactéries comme Salmonella typhimurium, Escherichia coli
ou Bacillus subtilis.
2- Tests sur champignons: les tests destinés pour la détection mutagène sur les champignons
et les levures.
3-Tests sur cellules de mammifères en culture: les tests destinés à mettre en évidence des
altérations des chromosomes et l’induction de mutation cellules de mammifères en culture.
4- Tests sur animaux in vivo: les tests destinés à montrer l’induction de lésion chromosomale
en utilisant soit le test du micronucleus, soit l’étude au stade métaphase de cellules de la
moelle osseuse ou d’autres cellules en division.
Chacun de ces tests a ses avantages et ses limites aussi.

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2. Analyse des résidus toxiques dans les aliments
Parmi les substances intervenant dans la production des aliments et susceptibles de les rendre
dangereux pour la santé des consommateurs, si leurs présence est excessive, figurent les
résidus de pesticides. FAO/OMS coopèrent dans un programme mixte sur les normes
alimentaires pour la fixation d’une dose journalière acceptable (DJA), ainsi que la proposition
des limites maximales de résidus (LMR) dans des denrées alimentaires spécifiques ou dans
certains cas dans des groupes alimentaires par le Codex Alimentarius.
2.1. Relation entre les LMR et les risques
La concentration en résidus la plus élevée légalement acceptable pour que les denrées
alimentaires restent commercialisables, elle s’exprime en milligramme de résidus par
kilogramme de produit alimentaire. Elle représente selon le Codex les résidus acceptables sur
le plan toxicologique, elle est fondée sur les données des Bonnes Pratiques Agricoles et est
destinée à être appliquée dans le commerce international.
2.2. Dose journalière admissible et appréciation des risques
La quantité d’une substance pouvant être quotidiennement consommée au cours d’une vie
entière sans présenter le moindre risque ou effet secondaire. Elle est déterminée en divisant la
dose sans effet (DSE) de l’animal le plus sensible par 100, la dose sans effet étant déduite
d’après des études toxicologiques menées à long terme (18-24 mois) sur les animaux. Elle
s’exprime en milligramme (ou microgramme) de résidus par kilogramme de poids corporel.
L’application d’une relation telle que:

LMR= (1000 w/a) × DJA ou LMR= K × DJA

avec w= poids du sujet (en Kg) et a= consommation quotidienne moyenne (en g) par
personne, conduisait à une limite directement déduite des données toxicologiques acquises et
pouvant servir de référence (poids corporel moyen d’un adulte est 60 Kg).
Pour évaluer l’absorption des résidus des produits phytosanitaires, il n’y a pas lieu de retenir
la consommation de poissons et de crustacés. Les viandes et les produits laitiers ne peuvent
par ailleurs renfermer ces résidus qu’à un second degré puisqu’ils dérivent de ceux présents
dans l’alimentation animale et leurs taux ne pourront être que très faibles pour des produits
biodégradables.
Les LMR de pesticides dans les céréales relèvent de considérations différentes de celles
retenus pour les fruits et légumes, puisqu’elles concernent des teneurs dans une denrée
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toujours appelée à subir des transformations avant son ingestion par l’homme. De plus ces
pesticides ne représentent qu’une partie de ceux utilisés de fruits et légumes. Il est donc
encore possible de traiter le cas des limites concernant les fruits et légumes indépendamment
de celui des céréales.

2.3. Résidus admis aux limites de détermination

« On entend par limite de détermination, la concentration d’un résidu de pesticide la plus
faible que l’on puisse déterminer et mesurer quantitativement dans une denrée alimentaire
spécifique, un produit agricole ou un aliment pour animaux avec un degré de certitude
acceptable au moyen d’une méthode d’analyse réglementaire», selon le codex Alimentarius.
La limite de détermination d’un résidu de pesticide dans une denrée alimentaire quelconque
est dépendante de deux facteurs principaux :
- la sensibilité instantanée de l’appareil utilisé,
- la nature de la matière alimentaire entrainant la présence d’interférences.

En pratique, la limite de détermination des résidus de pesticides se situe entre 0.01 et 0.1
mg/Kg pour les produits d’origine végétale. Avec les organochlorés persistants et les
organophosphorés les plus courantes, 0.01 mg/Kg constitue une limite dont l’abaissement
peut conduire à des erreurs aussi bien qualitatives que quantitatives. Avec les carbamates et
les produits divers, 0.05-0.1 mg/Kg sinon davantage constituent des limites de détection
parfois difficiles à obtenir.
Pour les matières alimentaires d’origine animale, les difficultés d’élimination des substances
interférentes, matières grasses notamment, sont plus grandes mais moins variées que dans le
cas des végétaux.
Dans l’analyse des boissons, les limites de déterminations peuvent être abaissées en fonction
des réponses des détecteurs et des pesticides concernés jusqu’à quelques nanogrammes ou
dizaines de nanogrammes par litre.

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2.4. Analyse des résidus de pesticides
Selon la nature des pesticides étudiés, deux techniques analytiques de séparation sont
généralement employées pour leur identification et leur quantification : la chromatographie en
phase gazeuse (CPG) et la chromatographie en phase liquide (CPL). Ainsi, tout en apportant
de la spécificité, la spectrométrie de masse (SM) a pour intérêt d’être un outil de détection
quasi universel. Plus tardivement, le couplage de la spectrométrie de masse à la CPG a permis
un gain en sensibilité et un grand spécificité du signal par rapport aux couplages développés
avec d’autres systèmes de détection.
La CPL à polarité de phase inverse avec un gradient d’élution est la stratégie la plus
communément utilisée pour l’analyse multi-résidus de pesticides.
Ainsi, la CPL couplée à des détecteurs de type ultraviolet (UV) ou fluorescence a été adoptée
comme une technique complémentaire à la CPG dans le domaine de l’analyse de résidus de
pesticides. Le manque de détecteur performant et universel a été surmonté avec le couplage à
la détection par SM. De plus, associées à la SM, la CPL et la CPG restent deux techniques
séparatives très complémentaires dans le domaine de l’analyse de pesticides.
L’extraction des pesticides de matrices solides est une étape primordiale du processus
d’analyse globale. Cette étape est cependant difficile lorsque de nombreux composés sont
recherchés simultanément. L’extrait est souvent traité de façon à utiliser un solvant
compatible avec les étapes suivantes du traitement de l’échantillon. Certaines applications
mettent en évidence la complexité des matrices alimentaires avec la nécessité d’utiliser en
tandem des adsorbants de natures diverses.

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