Département de Biologie

Biochimie structurale
Cours S3 SVI

ACIDES AMINES - PROTEINES

Année universitaire 2020 - 2021

Pr. Mohamed ABDERRAZIK
Laboratoire AgroBioVal, Equipe Sciences des Aliments
abderrazik@uca.ac.ma

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 SOMMAIIRE

INTRODUCTION

A- LES ACIDES AMINES (aminoacides)

I. Structure et classification

I.1. Structure des acides aminés

I.1.1. Motif structural commun
I.1.2. Acides aminés protéinogènes
I.1.3. Classifications
I.1.4. Acides aminés non protéinogènes

II. Propriétés physiques

II.1. Isomérie optique

II.2. Solubilité
II.3. Hydrophobicité
II.4. Propriétés spectrales, absorbance de la lumière UV

III. Propriétés chimiques

III.1. Propriétés ioniques

III.1.1. Fonction carboxylique
III.1.2. Fonction amine
III.1.3. Titrage d’un aminoacide

III.2. Réactivité de la fonction amine

III.2.1. Méthode de Sanger
III.2.2. Dansylation : réaction avec le chlorure de dansyl
III.2.3. Réaction avec le phényl-isothyocyante (PITC)

III.3. Réactivité de la fonction carboxylique

III.3.1. Réactions avec les bases fortes (salification)
III.3.2. Réaction avec les alcools (estérification)
III.3.3. Réaction de décarboxylation
III.3.4. Réaction avec les amines
III.4. Réactivité des fonctions NH2 et COOH conjointes : Réaction à la ninhydrine
III.5. Réactivité des chaines latérales
III.5.1. Chaîne latérale de la cystéine
III.6. Liaison peptidique

IV. Quelques techniques d’analyse

IV.1 Electrophorèse

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 IV.2. Chromatographie de partage
IV.3. Chromatographie d’exclusion
IV.4. Chromatographie échangeuse d’ions

B. STRUCTURE PRIMAIRE ET SEQUENÇAGE :

I. Séquence d’un peptide :

I.1. Détermination de la structure primaire d’un peptide :

I.1.1. Stratégie générale :
I.1.2. Fragmentation :
I.1.2.1. Détermination de la composition en acides aminés :
I.1.2.2. Coupures chimiques :
I.1.2.3. Coupures enzymatiques :
I.2.3.1. Dégradation d’Edman :
I.2.3.2. Identification du résidu N terminal :
I.2.3.3. Identification du résidu C terminal :

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INTRODUCTION
Le mot « Protéine », du grec « proteios » signifie « première importance ».
Les protéines sont des constituants des cellules vivantes d’une extrême importance, aussi bien
qualitativement que quantitativement.
Ce sont des macromolécules de type polymère (contrairement aux lipides). Le nombre de
protéines différentes est de l’ordre de 2000 dans une cellule procaryote, alors que chez les
cellules eucaryotes, cette quantité peut atteindre 2 à 15000.
Chacune des protéines présentes dans les cellules a une structure qui est déterminée
génétiquement et de ce fait, possède une taille prédéfinie, sauf en cas de mutation ou altération
post traductionnelle (voir cours des acides nucléiques).
Elles ont des rôles très variés au sein d’une cellule ou d’un organisme. Chaque protéine joue un
rôle particulier et est souvent indispensable pour le bon fonctionnement de l’ensemble.
Le nombre de copies d’une protéine donnée dans une cellule est également critique. Comme
c’est le cas du transporteur de glucose GLUT2 dans la cellule hépatique, où la quantité normale
est de l’ordre de 150.000. En dessous du seuil de 20.000, cela entraine un diabète.
Les protéines sont synthétisées et dégradées en permanence dans les cellules.

Quelques rôles des protéines :

Parmi les nombreux rôles que jouent les protéines dans la structure et le fonctionnement de la
cellule ou de organisme vivant, on peut citer les rôles suivants :
Elles jouent le rôle de transporteurs :
- canaux ioniques
- transporteurs de sucres, acides aminés…
- transporteurs de lipides entre organes (albumine, apolipoprotéines)
- transport inverse, élimination des toxiques
Elles interviennent dans l’immunité :
- anticorps (immunoglobulines…)
- protéines du système du complément
- protéines de la cicatrisation (fibrine…)
- protéines du CMH (Complexe Majeur d’Histocompatibilité)
Elles ont des rôles structuraux :
- cytosquelette (tubuline, actine…)
- contraction musculaire (myosine…)
- organisation de l’ADN (histones)

Peptides et protéines :
Tous deux sont des polymères d’acides aminés.
Un peptide est le plus souvent une petite protéine qui peut dialyser, avec une limite imprécise
dans la dimension. Autrefois, on la fixait à 10000 daltons (soit 80-100 acides aminés).
Aujourd’hui, on considère l’insuline comme la plus petite des protéines (5734 daltons).
oligopeptides < polypeptides < protéines

4
L’hydrolyse des molécules protidiques (peptides et protéines) libère toujours un mélange de
composés à structure caractéristique : les acides aminés.
Le terme protide désigne donc l’ensemble des acides aminés naturels et de leurs combinaisons
chimiques qui sont les peptides (enchaînement d’un petit nombre d’acides aminés, structure
simple) et les protéines (enchaînement d’un grand nombre d’acides aminés, architecture
complexe).

Structure primaire, secondaire, tertiaire et quaternaire :

La structure primaire désigne la nature des acides aminés et l’ordre dans lequel ceux-ci sont
reliés par des liaisons covalentes (liaisons peptidiques).
La structure secondaire correspond aux structures spatiales régulières (hélices α, plis β, feuillets
β etc…).
La structure tertiaire est définie par l’arrangement dans l’espace de ces structures secondaires,
c’est à dire la position dans l’espace de chaque atome.
La structure quaternaire est une association de structures tertiaires : certaines protéines existent
sous forme de complexes comportant plusieurs sous-unités, reliées par des liaisons faibles qui
peuvent être séparées en jouant sur la force ionique.

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 B- LES ACIDES AMINES (aminoacides) :

V. Structure et classification :

I.1. Structure des acides aminés :

Les acides aminés (ou aminoacides) sont des composés comportant toujours un motif structural
commun : une chaîne carbonée plus ou moins longue, une fonction acide carboxylique (-COOH)
et une amine primaire (-NH2), à l’exception de la proline qui porte une fonction amine
secondaire.

I.1.1. Motif structural commun :

Dans les acides aminés naturels, qui constituent les peptides et protéines, ces deux fonctions sont
supportées par le même carbone, noté Cα, d’où le terme d’acides α aminés.

Groupement amine Groupement carboxylique

Le radical (R) ou chaine latérale est la partie variable des aminoacides permettant leur
classification. Il peut être purement hydrocarboné ou porter un groupement fonctionnel (acide,
base, alcool, thiol…). Il existe plusieurs types de classifications, toutes basées sur la nature de R,
mais la plus utilisée est celle qui consiste à les classer en 3 groupes : non polaires, polaires non
chargés et polaires chargés.
Il s’agit d’une molécule amphotère (acide et basique à la fois).

La forme non chargée (1), n’est retrouvée qu’en très faible proportion (0,001% au mieux). En
solution neutre, les 2 fonctions, carboxylique et amine, se dissocient et l’acide aminé porte alors
une charge (-) et une charge (+), tout en étant globalement neutre, forme (2).
Selon le pH du milieu, l’aminoacide peut être soit acide, soit basique soit neutre.

(1) (2) (3)

(1) En solution à pH neutre, la forme ionisée est prépondérante : Forme A+/-
(2) En milieu acide, la forme protoné est prépondérante : Forme A+
(3) En solution à pH basique, la forme ionisée est prépondérante : Forme A-
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 I.1.2. Acides aminés protéinogènes :

Nom Structure semi développée Chaine latérale Symbole

Glycine
H Gly
ou Glycocolle

Groupement
Alanine Ala
méthyle

Groupement
Valime Val
isopropyle

Groupement
Leucine Leu
isobutyle

Groupement
Isoleucine Ile
butyle secondaire

Groupe α-
Proline Pro
aminocarboxylique

Serine Alcool primaire Ser

Thréonine Alcool secondaire Thr

Cystéine Groupement thiol Cys

Groupement
Methionine Met
thioether

Groupement
Phénylalanine Phe
phényle

Groupement
Tyrosine Tyr
phénol

Groupement
Tryptophane Trp
indole

Acide Groupement β-
Asp
aspartique carboxyle
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 Acide Groupement γ-
Glu
glutamique carboxyle

Amide de l’acide
Asparagine Asn
aspartique

Amide de l’acide
Glutamine Gln
glutamique

Groupement
Lysine Lys
ε-amine

Groupement
Arginine Arg
δ-guanidyle

Groupement
Histidine His
imidazole

Quelques remarques :
Pro : Le groupe -amino est engagé dans une structure cyclique. L'amine est une amine
secondaire (imine) dont l'azote présente un doublet libre, accepteur de proton : la fonction
basique de la Pro est donc conservée.
Tyr : La chaine latérale porte un groupement phénol, qui est un alcool aromatique. C’est un
acide très faible dont la forme basique conjuguée est un phénate.
Trp : La délocalisation des électrons au sein du noyau indole affecte les propriétés basiques du
Trp. Contrairement au noyau imidazole de l’His, le doublet non liant de N n’est plus accepteur
de protons.
Asp et Glu : Le groupement carboxyle (β pour Asp et γ pour Glu) est un donneur de proton.
C’est pourquoi ils sont considérés comme AA acides. Le groupement carboxyle est chargé
négativement à pH physiologique (forme base conjuguée).
Asn et Gln : Ce sont respectivement les amides de Asp et Glu. Le groupement amide n'est pas
protonable : le doublet électronique de l'azote est délocalisé et engagé dans une orbitale hybride
sp2 avec les atomes C et O.
Lys : Cet aminoacide est considéré comme AA basiques car sa chaine latérale porte un
groupement ε-amino qui est un accepteur de proton.

Arg : La fonction amine, qui fait partie du groupement δ-guanidyle, confère à l’Arg un caractère
basique.

Cys : Le groupement thiol (SH) ou sulfhydrile est un donneur de proton, c'est un acide très faible
(forme base conjuguée : thiolate). Lorsque la cystéine est incorporée dans un protéine (ou

8
peptide), sa fonction thiol joue un rôle très important dans la structure tridimentionnelle car elle
est responsable de la formation des pont disulfure.

I.1.3. Classifications :
Dans la nature, on retrouve des centaines d’acides aminés, dont seulement 20 entrent dans la
composition des protéines : les aminoacides protéiques ou protéinogènes.
Suivant la nature de la chaine latérale et les propriétés qui en découlent plusieurs critères de
classification des acides aminés (AA) peuvent être retenus :
• Classification selon la polarité de la chaine latérale :
Cette classification est la plus souvent utilisée. Elle permet de classer les aminoacides en 2
grands groupes : AA polaires et AA apolaires.

• Structure linéaire ou cyclique de R

- AA aliphatiques (R non cyclique)
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 - AA aromatiques (R cyclique de type benzénique)
- AA hétérocycliques (R cyclique avec un atome autre que le carbone dans le cycle)
• Présence ou non dans R d’un groupement pouvant prendre une charge électrique
- AA neutres
- AA acides (charge potentielle négative)
- AA basiques (charge potentielle positive)
• Présence ou non d’un groupement fonctionnel dans R
- AA hydrocarbonés (pas de groupement fonctionnel, chaîne aliphatique ou cycle aromatique)
- AA hydroxylés (présence d’un groupement alcool ou phénol dans R)
- AA soufrés (présence d’un groupement thiol ou thiol-éther dans R)
- AA hétérocycliques (R est un hétérocycle)
- AA acides (présence d’un groupement acide carboxylique dans R)
- AA amide (dérivent des précédents par amidification)
- AA basiques (présence d’un groupement azoté, amine ou autre, dans R)
- AA particulier : fonction amine en α est une fonction amine secondaire

ères
Les AA sont symbolisés soit par un code à trois lettres (en général les trois 1 du nom) commençant par
une majuscule soit par un code à une seule lettre.
La masse molaire d’un acide aminé varie entre 75 pour la glycine et 204 pour le tryptophane.
Elle est en moyenne de 115 g/mole. Ce qui signifie qu’une protéine formée par la condensation
de 50 AA aura donc une masse molaire de 50 x 115 = 5750 g/mole.
Quand une protéine est formée de 50 acides aminés on dit qu’elle est composée de 50 résidus
d’acides aminés car il y a eu formation de 49 liaisons peptidiques et donc libération de 49
molécules d’eau. Il ne reste donc que des acides aminés déshydratés : des résidus.
Ces notions seront vues plus en détail dans la section « liaison peptidique »
Il est important de noter que 8 de ces aminoacides sont indispensables chez l’adulte et 9 chez
l’enfant, ce sont : histidine (enfant), leucine, isoleucine, lysine, méthionine, phénylalanine,
thréonine, tryptophane, valine.

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 I.1.4. Acides aminés non protéinogènes :
On retrouve dans la nature des acides aminés aux structures beaucoup plus variées mais qui ne
sont pas incorporés dans des protéines. En voici quelques exemples :

On retrouve également beaucoup d’acides aminés de la série D (cf. Isomérie optique)

VI. Propriétés physiques :

II.1. Isomérie optique :

A l’exception du glycocolle (R = H), les Cα de tous les aminoacides portent 4 substituants
différents. Ils sont dits asymétriques. Le Cα est un centre asymétrique (centre chiral) dont la
conformation définira les stéréoisomères : isomères optiques à pouvoir rotatoire spécifique
opposé : Ils dévient la lumière polarisée plane à droite où à gauche. D’où la notion d’isomérie
optique.

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La molécule optiquement active est asymétrique, elle n’est pas superposable à son image dans un
miroir. Le Cα est appelé centre asymétrique ou centre chiral.
Les deux stéréoisomères ou énantiomères sont définis de la même manière que pour les oses en
prenant le glycéraldéhyde comme référence dans la représentation de Fischer :
Convention de Fischer (Emil Fischer 1891)
Dans ce système, la configuration des groupes autour d’un centre asymétrique est reliée au centre
chiral du glycéraldéhyde. Les stéréo-isomères (+) et (-) [dextrogyres et lévogyres] sont désignés
respectivement par D-glycéraldéhyde et L-glycéraldéhyde

L-glycéraldéhyde D-glycéraldéhyde
Les 2 isomères (énantiomères) sont définis de la même manière que pour les oses, en prenant le
glycéraldéhyde comme référence dans la représentation de Fischer

Glycéraldéhyde Aminoacide
Tous les -aminoacides protéiques ont la configuration stéréochimique L. Ceci n’a aucun
rapport avec le pouvoir rotatoire de la molécule : un aminoacide L peut être dextrogyre ou
lévogyre.

II.2. Solubilité :
En général à l’état solide, les aminoacides sous forme de poudres blanches cristallisées. Leur
solubilité dans les solutions aqueuses dépend de la polarité de leur chaine latérale. Plus la chaine
latérale est polaire, plus ils sont solubles.

II.3. Hydrophobicité :
Le caractère polaire ou apolaire des chaines latérales des aminoacides est l’un des principaux
responsables de l’organisation spatiale des protéines. Il permet de les classer en 4 familles selon
leur indice d’hydrophobicité :

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 II.4. Propriétés spectrales, absorbance de la lumière UV :
Les AA aromatiques absorbent les radiations lumineuses dans l’UV. Cette propriété permet
souvent de détecter la présence de protéines dans un milieu. Il s’agit d’une détection qualitative.

VII. Propriétés chimiques :

III.1. Propriétés ioniques :

La présence dans la même molécule d’au moins deux groupements fonctionnels antagonistes, l’un acide :
-COOH, l’autre basique : -NH2, donne des propriétés très particulières aux acides α aminés.
-
La forme acide du groupement acide carboxylique est –COOH, sa forme basique est –COO
+
La forme acide du groupement amine est –NH3 , sa forme basique est –NH2

Un groupement est d’autant plus acide (perd plus facilement son proton) que son pKa est faible.
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L’état d’ionisation d’un aminoacide dépend du pH du milieu. A pH neutre, l’aminoacide est sous
forme d’ions dipolaires ou zwitterion.

III.1.1. Fonction carboxylique :

Le pK1 ou pKCOOH est le pH de demi dissociation de la fonction COOH, c’est-à-dire le pH

auquel 50% de la fonction carboxylique est sous forme acide (COOH) et 50% sous forme
basique conjuguée (COO-). En effet, lorsque (COO-) = (COOH), le log du rapport est égal à
zéro. Le pH est donc égal à pKa.

III.1.2. Fonction amine :

Le pK2 ou pKNH3 est le pH de demi dissociation de la fonction NH3+, c’est-à-dire le pH auquel

50% de la fonction amine est sous forme acide (NH2) et 50% sous forme basique conjuguée
(NH3+).
En effet, lorsque (NH2) = (NH3+), le log du rapport est égal à zéro. Le pH est donc égal à pK2.

III.1.3. Titrage d’un aminoacide :

Chaque aminoacide se caractérise par 2 pKa au moins (pK1 et pK2). S’il possède une fonction
supplémentaire sur la chaine latérale, celle si a un pKR.
Selon les valeurs de pKa et le pH du milieu, l’acide aminé se trouve sous sa forme acide (A+),
neutre (A+/-) ou basique (A-).
Si la chaine latérale possède une fonction supplémentaire acide la forme la plus basique sera A2-

14
Si la chaine latérale possède une fonction basique supplémentaire, la forme la plus acide sera
A2+.

Exemple : Titrage d’un acide aminé neutre, cas de l’alanine :

Le pH isoélectrique (ou point isoélectrique) est le pH auquel l’aminoacide est globalement

neutre. Il est propre à chaque acide aminé :
Pour un acide aminé dont la chaine latérale ne possède pas de fonction ionisable,

pHi = 1/2 (pK1 + pK2)

Le titrage peut aussi être réalisé et les pK déterminés, en suivant la variation du pH en fonction
du volume titrant. C’est le cas du titrage qui sera réalisé en TP

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Variation des proportions des différentes formes d’ionisation en fonction du pH :

Si pH = pHi, la charge globale de l’AA est nulle (forme zwitterion A+/-)

Si pH < pHi, la charge globale de l’AA est positive (forme acide A+)
Si pH > pHi, la charge globale de l’AA est négative (forme basique A-)

Cas d’un acide aminé portant une fonction supplémentaire acide ou basique :
Lorsque la chaine latérale porte une fonction supplémentaire susceptible de libérer un proton,
l’acide aminé est dit « acide ». Le pKR aura une valeur acide (ex. Glu ou Asp)

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Lorsque la chaine latérale porte une fonction supplémentaire susceptible de capter un proton,
l’acide aminé est dit « basique ». Le pKR aura une valeur acide (ex. Glu ou Asp).
Ces notions seront développées en TD.

Valeurs de pK des différents aminoacides :

III.2. Réactivité de la fonction amine :

III.2.1. Méthode de Sanger :

C’est une réaction entre le α-NH2 de l’aminoacide et le 2-4-dinitrofluorobenzène (DNFB). Cette
réaction a permis à Frederik SANGER (1953) d'établir la première structure primaire d'une
protéine : l'insuline, hormone pancréatique qui contrôle la production et l'utilisation du glucose.

Dinitrophényl-AA (DNP-AA)
Le DNP- est un dérivé de couleur jaune, non hydrolysable en milieu acide, le NaHCO3 permet
de neutraliser l’acidité due au HF formé.
Application : Cette réaction est utilisée pour l’identification des AA en extrémité N-terminale
des peptides (cf séquençage des peptides)

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 III.2.2. Dansylation : réaction avec le chlorure de dansyl
(chlorure de diméthylaminonaphtalène sulfonyle)

Le DNS-aa est un dérivé de couleur jaune clair, non hydrolysable en milieu acide. Il est
fluorescent sous U.V. Il est détectable par chromatographie sur couche mince (CCM)
Application : Tout comme la réaction de Sanger, la réaction au DNS permet d’identifier l’acide
aminé N-terminal d’un peptide.

III.2.3. Réaction avec le phényl-isothyocyante (PITC)

Application : Cette réaction est également utilisée pour l’identification de l’AA en extrémité N-
terminale d’un peptide (cf séquençage des peptides).

III.3. Réactivité de la fonction carboxylique :

On retrouve ici les réactions avec les acides carboxyliques de façon générale (cf acides gras).

III.3.1. Réactions avec les bases fortes (salification) :

De façon générale, les acides carboxyliques, étant des acides faibles, peuvent réagir avec les
bases fortes (NaOH ou KOH) pour former des sels. Dans l’exemple ci-dessous, le sel formé est
un carboxylate de sodium.

Carboxylate de Na+

III.3.2. Réaction avec les alcools (estérification) :

Les acides carboxyliques réagissent avec les alcools pour former un ester et de l'eau. C’est cette
même réaction qui aboutit à la formation des lipides saponifiables (esters d’acides gras et
d’alcools)

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 III.3.3. Réaction de décarboxylation :
C’est une réaction qui aboutit à la formation d’une amine primaire.

La réaction peut se faire soit par voie chimique (chauffage de l’AA dans une solution inerte), soit
par voie enzymatique (sous l’action d’une décarboxylase).

III.3.4. Réaction avec les amines :

C’est une réaction de condensation qui aboutit à la formation d’une amide, avec élimination
d’une molécule d’eau.

III.4. Réactivité des fonctions NH2 et COOH conjointes : Réaction à la ninhydrine :

Application : Cette réaction est utilisée

pour identifier les AA d’un mélange après
séparation par chromatographie sur
papier. (cf TP acides aminés)
Bien que le produit soit toujours le même,
il y a des nuances dans la couleur (du
violet au marron). La proline donne une
tache jaune.

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 III.5. Réactivité des chaines latérales :
Les groupes latéraux réactifs des aminoacides sont :
- les carboxyles et amines : ils sont de réactivité identique à celles des groupes α
- les chaînes latérales contenant du soufre, des groupes imidazole ou aromatique autre que le
phényle inerte.

III.5.1. Chaîne latérale de la cystéine :

a. Ponts disulfures :
Le groupement thiol (SH) de la cystéine est très réactif. Son oxydation permet la formation des
ponts disulfures que l'on trouve dans les protéines (pont intra-chaîne ou inter-chaine). Ces
groupements thiols jouent un rôle fondamental dans la structure tridimensionnelle des protéines
et donc dans leurs activités biologiques (cf exemple de l’insuline).

La cystine ainsi obtenue résulte donc d’une liaison covalente entre deux molécules de cystéine.
Le résidu cystine joue un rôle de pont disulfure entre chaînes polypeptidiques intra ou
intermoléculaires. Il peut être coupé par des réducteurs comme le ß-mercaptoéthanol ou le
dithiotréitol avec libération de deux fonctions thiols.

Dithiotréitol (DTT) β-mercaptoéthanol

Exemple de l’insuline :

Les 2 chaînes polypeptidiques sont reliées entre elles par liaison S-S. Il y a 6 cystéines et 3 ponts
S-S : 15 possibilités de conformation dont une seule correspond à la protéine fonctionnelle.

20
 b. Alkylation :

Iodoacétamide
Cette réaction de blocage de la cystéine est une carboxy-amido-méthylation qui empêche
l’oxydation la cystéine lors de l’étude des protéines.

III.6. Liaison peptidique :

La liaison peptidique est une liaison amide qui résulte de la condensation de 2 acides aminés,
avec libération d’une molécule d’eau. C’est une réaction entre le groupement carboxyle du 1 er
AA et le groupement amine du second AA.

La liaison peptidique est très stable, plus stable qu’une liaison ester. Son hydrolyse nécessite des
conditions chimiques fortes : milieu alcalin très concentré ou HCl 6N, 110°C, 24 à 78 h. Ces
réactions sont utilisées pour la détermination de la composition globale en AA d’une protéine.
La condensation de n AA aboutit à la formation d’un peptide de n résidus avec libération de n-1
molécules d’eau :

21
Quelques peptides d’intérêt :
β-endorphine (morphine endogène) :

Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu-Phe-Lys-Asn-Ala-Ile-Val-Lys-Asn-Ala-His-Lys-Lys-Gly-Glu

C’est un peptide produit par le corps qui appartient à la famille des endorphines, secrétées par le
complexe hypotalamo-hypophysaire lors d’activité physique intense. Elles ont une
capacité analgésique et procurent une sensation de bien-être.
Vasopressine et ocytocine :

Vasopressine Ocytocine
Ces 2 peptides ne diffèrent que par 2 résidus :
La vasopressine agit sur le rein en provoquant la rétention d’eau (effet vasoconstricteur)
L’ocytocine agit sur la contraction des muscles lisses en particulier l’utérus lors de
l’accouchement.
Aspartame : L-aspartyl-L-phénylalanine méthyl ester : C’est un édulcorant artificiel
découvert en 1965. C'est un dipeptide composé de deux acides aminés naturels, l'acide L-
aspartique et la L-phénylalanine, ce dernier sous forme d'ester méthylique.

22
 VIII. Quelques techniques d’analyse :
Ces techniques seront abordées en détail dans le cadre du module « techniques d’analyses »

IV.1 Electrophorèse :
C’est une technique analytique qui a pour but de séparer des molécules chargées au travers
d'un support (papier ou gel) sous l'effet d'un champ électrique.
Les molécules se déplacent vers le pôle de charge opposée à leur charge nette z.

Exemple : Séparation des acides aminés d’un mélange en fonction de leurs pHi :

pH 1 : (pH très acide), les 3 AA sont chargés (+). Plus l’écart entre le pHi et le pH du milieu est
grand plus la charge (+) est importante. C’est pourquoi la Lys migre plus loin.
pH 6 : Asp et Ala échargés (-), vont migrer vers l’anode, avec une migration plus importante
pour Asp car l’écart entre le pHi et le pH du milieu est plus important. Lys, chargé (+) migre vers
la cathode.
pH 11 (pH > aux 3 pHi) : Etant chargés (-), les 3 AA migrent vers l’anode, avec une différence
des distances de migration, due à la différence des pHi.
23
IV.2. Chromatographie de partage :

C’est une méthode de séparation qui utilise deux phases non miscibles :
- Une phase stationnaire fixée sur un support inerte qui retient +/- les constituants du mélange
- Une phase mobile qui décroche et entraîne les molécules retenues sur la phase stationnaire.
Elle est basée sur la solubilité dans la phase mobile et la phase stationnaire, des constituants du
mélange.

Rapport frontal : RF
(ou coefficient de migration)

IV.3. Chromatographie d’exclusion :

Permet de séparer les molécules en fonction de leur taille
Les molécules dont le diamètre est supérieur à celui des pores sont exclues et sont éluées en
premier (avec le volume mort).

Les petites molécules sont retardées car incluses dans le gel

L’élution se fait dans l’ordre inverse des PM

Il existe une relation entre le volume d’élution et le logarithme du PM. Une courbe étalon établie
à l’aide de molécules de référence permet de déterminer le PM des molécules inconnues. Cette
technique est utilisée essentiellement pour les peptides et les protéines.

24
 IV.4. Chromatographie échangeuse d’ions :
C’est une résine portant des groupements ionisables qui ont la propriété d’échanger de façon
réversible certains de leurs ions

Résine cationique : Chargée négativement, Résine cationique : Chargée positivement,

elle échange les cations réversiblement. elle échange les cations réversiblement.

Exemple de séparation des AA du mélange Ala, Lys, Asp sur résine échangeuse de cations :
pH

A pH 1, tous les AA sont chargés (+). Ils sont retenus par la résine.
Au fur et à mesure qu’on augmente le pH, les AA perdent leur charge (+) et sont élués
(relâchés par la résine), par ordre d’acidité décroissante : Asp, Ala, Lys.

25
Exemple de résines échangeuses d’ions :

26
B. STRUCTURE PRIMAIRE ET SEQUENÇAGE :

I. Séquence d’un peptide :

La séquence d’un peptide est l’ordre d’enchaînement des AA. Par convention un peptide s’écrit
en commençant par l’extrémité N terminale, (groupement –NH2 libre) et en terminant par
l’extrémité C terminale (groupement –COOH libre). C’est le sens dans lequel l’ARNm est
traduit en peptide.
Exemple de peptide : Tétrapeptide glutamyl⎯cystényl⎯lysyl⎯glycine

Les AA peuvent être représentés par leurs symboles à 3 lettres ou 1 lettre.

Le peptide s’écrit alors Glu-Cys-Lys-Gly, ou bien E-C-K-G

I.1. Détermination de la structure primaire d’un peptide :

I.1.1. Stratégie générale :

I.1.2. Fragmentation :
L’analyse de la structure d’une protéine et la détermination de sa structure primaire, passe
d’abord par une étape d’extraction et de purification. Si la protéine est de grande taille, il est
indispensable de la fragmenter en peptides de taille plus petite, qui seront analysés et séquencés
individuellement.
Cette fragmentation peut être réalisée par des enzymes spécifiques (endopeptidases), ou des
agents chimiques tels que le Bromure de cyanogène (CNBr) qui a une spécificité de coupure
après les résidus Met, ou bien HCl à faible concentration (hydrolyse acide ménagée).

27
I.1.2.1. Détermination de la composition en acides aminés :
Déterminer la structure primaire d’un peptide ou une protéine, c’est identifier les AA et définir
l’ordre dans lequel ils apparaissent, reliés par des liaisons peptidiques.
La première étape est donc la détermination de la composition globale en AA du peptide
(composition brute). Pour cela, il faut hydrolyser toutes les liaisons peptidiques et identifier les
différents AA présents dans l’hydrolysat.
La liaison peptidique est très stable, son hydrolyse spontanée est impossible. Il faut faire appel à
des conditions chimiques drastiques : Hydrolyse acide forte ou hydrolyse alcaline forte.
L’hydrolyse acide totale consiste à traiter le peptide par HCl 6N à ébullition 24 à 72 heure. Ce
qui aboutit à un hydrolysat contenant des aminoacides, qu’il faudra séparer et identifier par
HPLC (Chromatographie Liquide Haute Performance).
Toutefois, cette hydrolyse acide totale présente des restrictions :
- Les résidus Trp sont entièrement détruits
- Les amides (Gln et Asn) sont transformés en Acides correspondants (Glu, Asp)
- Tyr, Ser et Thr peuvent être partiellement détruits.
- Cys est transformée en acide cystéique.

Les aminoacides obtenus après hydrolyse totale sont marqués par une molécule fluorescente
(fluorochrome) qui permet de les détecter par HPLC. Ce marquage, (ou dérivation) est fait à
l’entrée (dérivation pré-colonne) ou à la sortie de la colonne HPLC (dérivation post-colonne).
Les aminoacides sont identifiés en fonction du temps de rétention.

I.1.2.2. Coupures chimiques :

Plus la taille du peptide est petite, plus son séquençage est aisé. Pour un peptide de grande taille
(>50 résidus), il est indispensable de procéder, au préalable, à la fragmentation en peptides de
plus petites tailles, purifier ces peptides, les séquencer individuellement et reconstruire la

28
séquence du peptide initial, comme on construit un puzzle, en identifiant les séquences
communes.

Il existe plusieurs méthodes de coupures spécifiques au niveau d’acides aminés donnés.

a. Bromure de Cyanogène (CNBr) : Coupe après les résidus Met.

En général, il y a peu de méthionines dans une protéine ce qui génère un nombre limité de
coupures par le CNBr.

b. N-bromosucinimide : coupe après les résidus Tyr

c. Hydrolyse acide ménagée :

Contrairement à l’hydrolyse acide totale qui nécessite des conditions extrêmes (HCl 6N,
chauffage à 100 °C pendant 24 à 72 h), l’hydrolyse acide ménagée (partielle) s’opère dans des
conditions plus douce.
La vitesse d’hydrolyse acide d’une protéine dépend de la nature de ses acides aminés. A titre
d’exemple, la liaison Val-Gly est coupé 100 fois plus vite que la liaison Gly-Gly.
Les liaisons Asp-Pro sont clivées spécifiquement par l’acide formique (HCOOH 70% pendant 24
à 96h et entre 20 et 40°C).
29
Les coupures n’étant pas complètes, certains peptides sont chevauchants (ont des extrémités
communes), dont l’identification permet de retrouver la structure du peptide initial (cf exercice
11 du TD)

I.1.2.3. Coupures enzymatiques :

Il existe de nombreuses enzymes (endopeptidase) spécifiques de l’hydrolyse de liaisons
peptidiques entre acides aminés particuliers, (spécificité en amont ou en aval du résidu). En voici
quelques exemples :

a. Trypsine : Endopeptidase qui coupe en aval des résidus basiques : Lys et Arg.
Exemple :
Gly-Tyr-Ile-Glu-Arg-Leu-Trp-Val-Lys-Cys-Asn-Ala
On obtient 1 pentapeptide, 1 tetrapeptide et 1 tripeptide.
On peut également dire qu’elle coupe Lys ou Arg du côté C terminal (c’est-à-dire le sens Ct),
mais ne jamais dire « coupe le Ct de Lys ou Arg ». Le Ct c’est l’extrémité du peptide.

b. Chymotrypsine : Endopeptidase qui coupe après les résidus aromatiques : Phe, Tyr, Trp.
Exemple :
Gly-Tyr-Ile-Glu-Arg-Leu-Trp-Val-Lys-Cys-Asn-Ala
On obtient 1 dipeptide et 2 pentapeptides

c. Endopeptidese V8, isolé de staphylococcus aureus. Elle coupe après les résidus acides :
Glu et Asp.
Exemple :
Gly-Tyr-Ile-Glu-Arg-Leu-Trp-Val-Lys-Cys-Asn-Ala
On obtient 1 tetrapeptide et 1 octapeptide.

d. Asp N protéase : Elle est spécifique des liaisons peptidiques en amont de Asp et Glu et
acide cystéique (Cys oxydée)
Exemple :
Gly-Tyr-Ile-Glu-Arg-Leu-Trp-Val-Lys-Cys-Asn-Ala
On obtient 2 tripeptides et 1 hexapeptide
Il existe d’autres endopeptidases qui sont ont une spécificité beaucoup plus large telles que la
Protéinase K, la papaïne, le pepsine…
Lorsque a protéine est sous sa forme native, le site de coupure enzymatique est souvent
inaccessible. La protéine résiste donc à l’action de ces protéases. Il est nécessaire de passer au
préalable par une étape de dénaturation.
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On utilise des agents dénaturants qui vont désorganiser la structure tridimensionnelle de la
protéine : Urée, , SDS…
Chlorure de guanidium 6M

Urée 8M
Sodium dodécyl sulfate (SDS)
On dilue ensuite l’agent dénaturant jusqu’à une concentration de 1 M afin que la protéine reste
dénaturée mais que la protéase (qui est également une protéine) conserve son activité.

I.2.3. Microséquençage :

I.2.3.1. Dégradation d’Edman :

Cette méthode, mise au point en 1949 par Pehr
Victor Edman (1916-1977), consiste à dégrader le
peptide à partir de l’extrémité N terminale. C’est une
méthode dite récurrente car elle permet de
d’identifier les résidus un après l’autre en dégradant
le peptide du côté Nt.
La méthode a été automatisée en 1967

La dégradation d’Edman consiste à faire réagir le phénylisothiocyanate (PITC) sur la fonction

amine terminale (cf propriétés chimiques, fonction amine).
La réaction se déroule en 3 étapes qui seront suivie de l’identification du résidu Nt par HPLC.

a. Couplage :

PITC peptide Phénythiocarbamoïl-peptide à n résidus

à n résidus

b. Coupure :
Il s’agit d’une réaction rapide en milieu anhydre en présence d’un acide organique qui n’entraine
pas de coupures non spécifiques des liaisons peptidiques comme HCl.

PTH-peptide à n résidus Thiazolidinone peptide à (n-1) résidus

La thiazolidinone est extraite au CH2Cl2. Le peptide (n-1 résidus) précipite dans ces conditions.
Il est récupéré et utilisé pour un nouveau couplage.

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 c. Conversion de la thiazolidinone en Thioidantoïne :

Le phénylthiohydantoïne-aminoacide (PTH-aa) est extrait à l’acétate d’éthyle.

Le PTH-aa est identifié par HPLC.
Le peptide à n-1 résidus est traité de la même manière que le peptide initial à n résidus pour
identifier l’aminoacide suivant (en position 2 dans le peptide). Un cycle entier correspondant aux
3 phases (couplage, coupure, conversion) permet d’identifier un aminoacide. Mais cette méthode
n’est pas utilisable indéfiniment, car le rendement diminue à chaque cycle.
Chacune des 3 étapes a un rendement de 98-99% soit 95% de rendement pour un cycle.
Pour 10 cycles : 0,9510 = 0,6 → 60% de rendement.
Pour 20 cycles : 0,9520 = 0,3 → 30% de rendement.
La dégradation d’Edman manuelle permet d’identifier 10 à 20 résidus (soit 20 cycles) et
nécessite entre 10 et 100 nmoles de peptide.
La dégradation d’Edman automatisée permet d’identifier jusqu’à 50 résidus et nécessite moins
de matériel (10 à 20 pmoles).

Exemple d’identification d’aminoacides Nt par HPLC :

Le principe de la HPLC est basé sur les propriétés d’hydrophobicité des PTH-aa.
La colonne HPLC est étalonnée avec les 20 PTH-aa marqués par un fluorochrome qui permet de
les détecter en UV. Chaque aminoacide a un temps de rétention caractéristique.

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L’extrémité N terminale du peptide est donc : Ala-Ile-Gly-Ala-Phe-Val….
L’intensité du pic diminue à chaque cycle (rendement) et on voit apparaître des petits pics
parasites (résidus de cycles précédents, acides aminés oxydés…).

I.2.3.2. Identification du résidu N terminal :

Il existe plusieurs techniques permettant d’identifier le résidu Nt, parmi lesquelles celles déjà
vues dans la section 2.1. (propriétés chimiques de la fonction amine).

a. Méthodes utilisant une hydrolyse acide :

Un acide aminé N-terminal libre comporte une amine primaire qui va réagir avec les réactifs vus
précédemment.
Après couplage du peptide dont on veut identifier l’aminoacide Nt, avec DNP ou DNS etc…
l’hydrolyse acide donnera un mélange contenant d’aminoacides libres, en plus d’un seul AA du
type DNP-aa ou DNS-aa qui était l’acide aminé N-terminal du peptide initial.
Inconvénient : l’utilisation d’acide concentré détruit tous les résidus Trp, et partiellement les
résidus Ser,Thr et Cys. En plus les résidus Asn et Gln se transforment en Asp et Glu.

b. Extrémité Nt bloquée :
Toutes les méthodes vues précédemment échouent si l’extrémité Nt n’est pas nucléophile.

- Extrémités N-terminales acétylées : cas de certains cytochromes.

- extrémités N-terminales avec base de Schiff : cas de l’hémoglobine A1C

Cyclisation spontanée de Glu en position N terminale et formation de pyro-glutamate

I.2.3.3. Identification du résidu C terminal :

a. Hydrazinolyse :
L’hydrazine (H2N-NH2) attaque toutes les liaisons peptidiques et donne des dérivés hydrazide
d’acide sauf pour l’acide aminé C-terminal qui reste intact.

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Ensuite avec la réaction de Sanger (DNFB), on obtient des DNP-aa.-hydrazine et 1 DNP-aa. pour
l’acide aminé qui était C-terminal.

b. Carboxypeptidases A, B
Ce sont des exopeptidases qui hydrolysent les liaisons peptidiques de façon récurrente en
commençant par l’extrémité C-terminale
La vitesse de coupure varie d’une liaison peptidique à l’autre. La carboxypeptidase A coupe mal
entre X-Arg et X-Lys, alors que la B coupe essentiellement ces liaisons. Généralement, on utilise
un mélange de A et B.
A l’instar de la dégradation d’Edman, l’action des carboxypeptidases est récurrente.
On fait donc des cinétiques de coupure et on analyse le mélange d’acides aminés en fonction du
temps.

Aminoacides témoins Temps de protéolyse en min

Résultat : L’extrémité C terminale du peptide est : - - - - aa8-aa4-aa6-aa7-aa2-aa5

Le résidu Ct est aa5. Nt Ct

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