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BACTRIES PHYTOPATHOGNES
Ce document a pour objectif de prsenter les diverses techniques utilises au
Laboratoire de diagnostic en phytoprotection pour la dtection et lidentification
des bactries phytopathognes.
Lisolement des bactries sur des milieux de culture gnraux ou diffrentiels
demeure souvent ltape de base pour le diagnostic des maladies bactriennes.
la suite de leur mise en culture, les bactries sont identifies par les techniques
suivantes :
Une dtection des bactries directement dans les tissus vgtaux peut tre
ralise par les techniques suivantes :
Des tests sont raliss pour vrifier la rsistance de certaines bactries des
produits utiliser dans le cadre de la lutte antiparasitaire.
Eau physiologique
strile (NaCl 0,85%)
tissu vgtal
symptomatique
1/10
1/100
Pour les tissus prsentant une laide dune anse inoculer strile, ensemencer par
pourriture molle, faire des dilutions puisement des milieux de culture spcifiques la
1/10 et 1/100.
bactrie recherche, afin d'obtenir des colonies isoles.
1/10
1/100
SPCIFICATIONS POUR LA
PRPARATION DES
ISOLEMENTS
MILIEU DE
CULTURE
TESTS POUR
LIDENTIFICATION DES
BACTRIES
CCT
API 20E
MS
Tests biochimiques
MS
Tests biochimiques
KB
Biolog
KB
LOPAT
LPGA
ELISA
CHANCRE
Erwinia amylovora
Erwinia carotovora subsp. atroseptica*
Erwinia carotovora subsp. carotovora*
Pseudomonas corrugata
Pseudomonas syringae
CCT
API 20E
NAP
Test biologique
SMSA
Biolog
LPGA
ELISA
LPGA
Biolog
POURRITURE MOLLE
Burkholderia cepacia
Erwinia pectinolytiques
Erwinia amylovora
Pseudomonas fluorescents et
pectinolytiques
MS
Tests biochimiques
CCT
API 20E
KB
LOPAT
KB
Biolog
LPGA
ELISA
KB
LOPAT
LPGA
Biolog
LPGA
Test biologique
LPGA
ELISA
PSEUDOMONAS FLUORESCENTS
Croissance : gnralement
abondante aprs 48 heures
Colonie : blanchtre crme
Pigment : fluorescent et diffus
dans le milieu
Diamtre moyen : 1 3 mm
(aprs 48 heures dincubation)
ERWINIA PECTINOLYTIQUE
XANTHOMONAS
Lorsquune bactrie du genre Xanthomonas est souponne, un milieu LPGA est
inocul et incub 26oC pour 24 72 heures. Aprs le temps dincubation, nous
recherchons sur le milieu de culture la prsence de colonies bactriennes jaune
ple jaune vif. Dans laffirmative, pour dterminer lespce ou le pathovar,
nous ralisons les tests suivants :
Xanthomonas
Xanthomonas
Xanthomonas
Xanthomonas
campestris
campestris
campestris
campestris
test Biolog
pv. armoraciae test biologique
pv. campestris test biologique
pv. pelargonii test ELISA
48 heures
72 heures
ERWINIA AMYLOVORA
Lorsque Erwinia amylovora est souponn, un milieu CCT est inocul et incub
26oC pour 24 72 heures. Aprs le temps dincubation, nous recherchons sur le
milieu de culture la prsence de colonies bactriennes particulirement convexes
et bleutes. Dans laffirmative, un test API 20E est ralis pour identifier la
bactrie.
Croissance : gnralement
abondante aprs 48 heures
Vue par du
dessus du Ptri
Vue du dessous
du Ptri
Oxydase Catalase
Oxydation/
Pectinase
Fermentation
Mthyl- Sucrose
glucoside
Production Croissance
dindole
35oC
Erwinia
Erwinia
caratovora
subsp.
carovotora
Erwinia
carotovora
subsp.
atroseptica
Erwinia
chrysanthemi
Lgende :
Oxydase
Catalase
Fermentation
Pectinase
Mthyl-glucoside
Sucrose
Indole
Groupe
Tests
Pseudomonas
Levane
Oxydase
Pectinase
Arginine
Hypersensibilit
dshydrolase
sur tabac
Ia
P. syringae
Ib
P. delphini
II
P. viridiflava
III
P. cichorii
IV a
P. marginalis
IV b
P. fluorescens
Va
P. tolaasii
Vb
P. fluorescens
Lgende :
Levane
Oxydase
Pectinase
Arginine dshydrolase
Transformation
dshydrolase.
Hypersensibilit du
tabac
de
larginine
(acide
amin)
par
larginine
API 20E
La galerie API 20E (bioMrieux) est une version miniaturise des tests
biochimiques classiques destins lidentification des Enterobacteriaceae
(bactries Gram ngatif et anarobies facultatives) dont font partie les Erwinia.
Ce systme regroupe 23 tests biochimiques. Des substrats dshydrats sont
contenus dans des microtubes. Ces substrats sont mis en solution grce
laddition dune suspension de la bactrie identifier. la suite dune priode
dincubation (24 heures 30oC), permettant la bactrie de ragir avec les
substrats, les diverses ractions sont notes afin de dterminer le code
didentification compos de 7 chiffres.
Au Laboratoire de diagnostic en phytoprotection, le systme API 20E est utilis
pour lidentification de Erwinia amylovora, agent responsable de la brlure
bactrienne chez les plantes de la famille des Rosaceae.
Pour Erwinia amylovora, les principaux codes didentification obtenus avec API
20E sont 0005522 et 0007522.
A- INOCULATION DUNE GALERIE API 20E
Aprs linoculation, remplir les cupules ADH, LDC, ODC, H2S et URE
dhuile minrale.
Placer les galeries dans une chambre humide (bote de plastique avec
couvercle contenant un papier humide) et incuber 30oC pendant 18
24 heures.
Lgende :
ONPG -
ADH
LDC
ODC
CIT
H2S
URE
TDA
IND
VP
GEL
GLU (glucose), MAN (mammitol), INO (inositol), SOR (sorbitol), RHA (rhamnose), SAC
(sucrose), MEL (mlobiose), AMY (amygdaline), ARA (L+arabinose) - formation dacide
la suite de lutilisation dun hydrate de carbone.
Contrle de qualit : Lire et consigner toutes les ractions avant laddition des
ractifs pour la rduction des nitrates et de lindole car ces ractions dgagent
des produits gazeux qui peuvent interfrer avec les autres preuves de la
galerie. Ne pas replacer le couvercle en plastique aprs laddition des ractifs.
Exemple dune galerie du systme API 20E avant laddition des ractifs
RACTIONS
TUBE
POSITIVE
NGATIVE
COMMENTAIRES
ONPG
Jaune
Incolore
ADH
Rouge ou orange
Jaune
LDC
Rouge ou orange
Jaune
ODC
Rouge ou orange
Jaune
Turquoise ou
Vert ple ou
bleu fonc
jaune
H2S
Dpt noir
URE
Rouge ou orange
Jaune
TDA
Brun-rouge
Jaune
IND
Anneau rouge
Jaune
Aucune diffusion,
incolore
CIT
VP
GEL
Diffusion du pigment
RACTIONS
TUBE
POSITIVE
NGATIVE
GLU
MAN
INO
SOR
RHA
SAC
MEL
AMY
ARA
GLU
Jaune
Bleu ou bleu-vert
Jaune
(rouge)
Prsence de bulles et
coloration jaune
N2 gazeux (prsence de
bulles)
Rduction
des
nitrates Prsence de NO2
COMMENTAIRES
Orange
(aprs lajout du
ractif de zinc)
BIOLOG
Les plaques Biolog GN 2 sont utiliss pour identifier les bactries Gram ngatif.
Lidentification des bactries est base sur lutilisation de 95 sources de carbone.
Une coloration pourpre est produite par la rduction de lindicateur, le
ttrazolium, en un compos color le formazan.
de 52 % + ou 3 % si une non-entrobactrie
de 63 % + ou 3 % si une entrobactrie
r l'lectrophotomtre ou tubidimtre,
lequel doit tre calibrer avec les
tubes standards de la compagnie
Biolog Inc.
Contrle de qualit : Le puits A1 doit tre incolore. Sil est violet, ne pas lire la
plaque.
TESTS SROLOGIQUES
Lutilisation danticorps pour le diagnostic des maladies bactriennes reprsente
une mthode spcifique et rapide. Au Laboratoire de diagnostic en
phytoprotection, les tests srologiques sont utiliss pour dtecter une bactrie
directement dans les tissus vgtaux ou pour identifier une espce bactrienne
isole sur milieu de culture glos.
Les anticorps sont des protines produites par le systme immunitaire des
vertbrs. Lorsquun antigne (composante trangre) est prsent chez un
vertbr, des anticorps sont labors contre celui-ci. Il est possible de produire
commercialement des anticorps destins au diagnostic des maladies
bactriennes. En injectant, dans une souris ou un lapin, une cellule bactrienne
ou une de ces composantes, des anticorps sont synthtiss contre cet antigne.
la suite du prlvement du sang, les anticorps sont purifis et ils peuvent tre
utiliss pour le diagnostic de lespce bactrienne concerne.Sur une cellule
bactrienne, plusieurs sites antigniques sont prsents et chacun induit la
production danticorps. Linjection dun antigne engendre donc la synthse de
plusieurs types danticorps dont lensemble est qualifi danticorps polyclonaux. Il
est possible dobtenir des anticorps ragissant spcifiquement avec un seul site
antignique. Ces anticorps sont dits monoclonaux. La spcificit accrue des
anticorps monoclonaux permet de raliser un diagnostic des plus fiable.
TEST SROLOGIQUE ELISA
oooooooooooooo
ooooooooooooooooo
oooooooooooooooooo
Anticorps de recouvrement
Incubation
Lavages
2- ADDITION DE LANTIGNE
oooooooooooooo
oooooooooooooooo
ooooooooooooooooo
Incubation
Suspension
bactrienne
Lavages
oooooooooooooo
ooooooooooooooooo
ooooooooooooooooo
Anticorps li lenzyme
Incubation
Lavages
Substrat
Incubation
Lecture
TEST BIOLOGIQUE
Le test biologique utilis pour le diagnostic des maladies bactriennes sert
diffrencier deux bactries phytopathognes affectant les crucifres soit
Xanthomonas campestris pv. campestris (nervation noire) et Xanthomonas
campestris pv. armoraciae (tache bactrienne). La base de ce test consiste
linoculation de plantules de chou et lobservation de symptmes diffrentiels.
A- INOCULATION DE PLANTULES DE CHOU
partir dune culture pure de 24 heures, inoculer laide dun cure dents
strile la tige lendroit o le cotyldon a t excis. Inoculer 3 isolats
diffrents pour chaque chantillon.
RFRENCE
Alvarez, A.M., A.A. Benedict, C.Y. Mizumoto, J.E. Hunter et D.W. Gabriel. 1994.
Serological, pathological, and genetic diversity among strains of Xanthomonas
campestris infecting crucifers. Phytopathology 84 : 1449-1457.
IMMUNOFLUORESCENCE
Limmunofluorescence est utilise pour la dtection de Clavibacter michiganensis
subsp. sepedonicus dans les tiges ou les tubercules de pomme de terre
souponns dtre affects par le fltrissement bactrien. Lutilisation dun
compos fluorescent (isothiocyanate de fluorescine) conjugu un anticorps
constitue la base de cette technique. Cest grce lobservation microscopique
sous une lumire ultraviolet quil est possible de visualiser les bactries. Dans le
cas dun chantillon contenant du Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus
les cellules bactriennes mettent une fluorescence vert brillant grce
lisothiocyanate de fluorescine.
1- RECOUVREMENT AVEC LANTIGNE
ou
Extraction
Anticorps
Sur milieu de culture levure peptone glucose agar (LPGA), repiquer 4 colonies
bactriennes isoles afin dobtenir des cultures pures. Diviser la bote de Ptri
en 4 quadrants.
g/L
Sucre de table
100.000
Sorbitol
10.000
30.0 ml
2.0 ml
Nutrient agar
23.000
* Cycloheximide
0.050
NOTES :
ISHIMARU, C. and E.J. KLOS, 1984. New medium for detecting Erwinia
amylovora and its use in epidemiological studies. Phytopathology vol. 74: 13421345.
g/L
Protose peptone #3 (Difco)
20.000
1.145
Sulfate de Mg (MgSO4.7H2O)
1.500
Agar (Bacto)
15.000
Glycrol
15.0 ml
KING, E.O., M.K. WARD and D.E. RANEY. 1954. Two simple media for
demonstration of pyocyanin and fluorescein. Journal of Laboratory and Clinical
Medicine 44, 301-7.
SHAAD, N.W., 1980.
bacteria. P.3.
g/L
Glucose
7.000
Peptone (Bacto)
7.000
Extrait de levure
7.000
Agar (Bacto)
15.000
NOTES :
g/L
Acide nicotinique
0.500
3.000
2.000
Sulfate de Mg (MgSO4.7H2O)
0.200
Taurocholate de Na (Difco)
2.500
Mannitol
10.000
Agar (Bacto)
20.000
ml/L
Tergitol 7
0.1
10.0
9.0
2.5
5.0
5.0
MILLER, T.D. and M.N. SCHROTH, 1972. Monitoring the epiphytic population of
Erwinia amylovora on pear with a selective medium. Phytopathology 62 : 11751182.
MILIEU ARGININE
g/L
Peptone (bacto)
1.000
Chlorure de Na (NaCl)
5.000
0.300
Agar (Bacto)
3.000
10.0 ml
Arginine HCl
10.000
NOTE :
Ajuster le pH 7.1.
Complter 1 litre avec H2O distille.
Distribuer 3ml de milieu par tube (16 mm) en agitant constamment afin de
bien rpartir lagar.
Thornley, M.J., 1960. The differentiation of Pseudomonas from other Gramnegative bacteria on the basis of arginine metabolism. Journal of Applied
Bacteriology, 23 : 37-52.
g/L
Peptone (Bacto)
20.000
Chlorure de Na (NaCl)
5.000
LELLIOTT, R.A., and R.S. DICKEY. 1984. Genus VII. Erwinia Winslow,
Broadhurst, Buchanan, Krumweide, Rogers and Smith 1920, 209. Pages 469476. In Noel R. Krieg and John G. Holt (eds.). Bergeys Manual of Systematic
Bacteriology. Volume 1. Williams and Wilkins, Baltimore, Md.
MILIEU LEVANE
g/L
Nutrient agar
23.000
D - glucose
2.500
Sucre de table
50.000
MILIEU METHYL-D-GLUCOSIDE
Solution 1
g/L
4.000
14.000
2.000
Solution 2
g/L
Agar (Bacto)
30.000
2.000
Solution 3
Sulfate de Mg (MgSO4.7H2O)
Solution 4
methyl-d-glucoside
Solution 5
Sel de tetrazolium (C19H15N4Cl)
g/100ml
10.000
g/100ml
20.000
g/100ml
1.000
Prparer toutes les solutions avec de H2O distille ; dissoudre les produits un
un dans 800 ou 80 ml H2O distille et complter 1 litre ou 100 ml selon la
solution prpare.
Mlanger 500 ml des solutions 1 et 2 (pour obtenir un volume final de 1 litre).
Striliser 20 minutes 121oC et 15 psi.
Pendant ce temps, striliser lautoclave : 1.0 ml de la solution 3
50.0ml de la solution 4
2.0 ml de la solution 5
o
20 minutes 121 C et 15 psi.
Laisser refroidir les 3 solutions striles. Ajouter ces solutions striles aux deux
premires lorsque le milieu aura atteint 45oC.
Laisser agiter 10 minutes et couler 18 20 ml de milieu par bote de Ptri.
NOTES :
DYE, D.W., 1968. A taxonomic study of the genus Erwinia. I. The amylovora
group. N.Z.J. Sci. 11: 590-607.
Agar (Bacto)
Extrait de levure
5.0 ml
5.0 ml
250.0 ml
200.0 ml
10.0 ml
H2O distille
100.0 ml
Sulfate de Mg (MgSO4.7H2O) 1M
24.648 g / 100 ml H2O distille
1.0 ml
g/L
Bleu de bromothymol
0.015
10.0 ml
Acide polygalacturonique
22.000
100.0 ml
NOTES :
g/L
Sucrose
40.000
Peptone (Bacto)
10.000
Extrait de buf
5.000
g/L
Citrate de Na (Na3C6H5O7.2H2O)
173.0
Carbonate de Na (Na2CO3)
85.5
Sulfate de Cu (CuSO4.5H2O)
17.3
RFRENCE
g/L
Nutrient agar
23.000
Sulfate de Cu (CuSO4)
0.200
RFRENCE
ARGININE DSHYDROLASE
Raction positive :
Raction ngative :
CATALASE
Dans un couvercle dune bote de Ptri ou sur une lame, dposer une goutte
de peroxyde dhydrogne 3%.
laide dun cure-dent prendre la bactrie identifier (culture de 18-24
heures) et la dposer dans la solution de peroxyde dhydrogne.
Attendre environ 2 minutes et lire la raction obtenue :
Raction positive :
prsence de bulles rvlant
le dgagement doxygne
Raction ngative :
absence de bulle
Raction positive :
La zone foliaire inocule avec
la bactrie devient
lgrement translucides et a
un aspect humide. Par la
suite, les tissus sasschent
et prennent une coloration
brun clair beige
LEVANE
laide dune anse inoculer strile, inoculer le milieu de culture levane par
stries avec la bactrie identifier (culture de 18-24 heures).
Raction ngative :
strie prostre
MTHYL-GLUCOSIDE
Le test Mthyl-glucoside sert dterminer si la bactrie peut crotre en
prsence de cette seule source de carbone.
laide dune anse inoculer strile, inoculer le milieu de culture mthyl-Dglucoside par points en dposant des amas de la bactrie identifier (culture
de 18-24 heures).
un
OXYDASE
Raction ngative :
Raction positive :
absence de coloration
OXYDATION/FERMENTATION
Faire bouillir sur une plaque chauffante jusqu ce que le contenu des tubes
devienne liquide.
Raction ngative :
(mtabolisme oxydatif)
Raction positive :
(mtabolisme fermentatif)
PECTINASE (ERWINIA)
Raction ngative :
absence dun halo blanc
Raction positive :
prsence dun halo blanc
(zone de prcipitation)
PECTINASE (PSEUDOMONAS)
Raction positive:
Raction ngative :
PRODUCTION DINDOLE
Raction positive :
Raction ngative :
TRANSFORMATION DU SUCROSE
Raction ngative :
le milieu reste
bleu-vert
Raction positive :
le milieu devient
jaune