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Laudato Romain Laverrire No Mage Samuel Joseph 28/03/2012

TP de Biochimie : Lipides
Introduction
Le but de ce travail pratique est de comparer les diffrences de proportion entre lipides de deux
souches de levure diffrentes (type sauvage et mutant). La mutation est ensuite identifie dans
la voie de synthse des lipides.

Les lipides sont des composants majeurs de toutes les cellules vivantes. La membrane celullaire
est essentiellement compose de lipides. Ils sont par consequent hydrophobes et donc
facilement extraits par des solvants organiques. Les lipides sont aussi utilise pour maintenir les
protines dans les membranes, stocker de lnergie et synthtiser des messagers chimiques.

Il existe diffrentes classes de lipides en fonction de leur groupes fonctionnels. On distingue

notament les phosphoglycerides, les sterols, les triglycrides et les sphingolipides.

Les phosphoglycerides sont composs de trois groupes principaux : un gylcerol, deux chaines
dacides gras lies au glycerol et un groupement phosphate esterifi au glycerol et li un alcool.
En fonction de la variation de ces groupes, il existe des centaines de phosphoglycerides
diffrents. La variation du groupe alcool donne les diffrents noms des phosphoglycerides. On
distingue les PA (pas de groupe alccol), les PG (glycerol), les PE (ethanolamine), les PC (choline),
les PS (serine) et les PI (inositol). Les phosphoglycerides sont les constituants majeurs des
membranes plasmiques.

Les strols sont une autre classe de lipide trs rpandue. Ils contribuent la fluidit des
membranes plasmiques et sont lorigine de la synthse de beaucoup de messagers chimiques
(hormones). Les strols sont tous synthtises partir de squalne.

Les triglycerides sont des lipides principalement utilise pour socker de lnergie. Ils ont la
mme structure que les phosphoglycerides mais ont une troisime chaine dacide gras lie au
glycrol la place du phosphate.

Les sphingolipides ont peu prs la mme fonction que les phosphoglycerides (constituant de
membranes) mais ont la particularit de contenir un azote dans leur structure.

Mthodologie

Extraction
Lanalyse porte sur les lipides dune colonie de levure, il est donc ncessaire dextraire ceux-ci
parmi tous les composants de lorganisme (protines, macromolcules, acides nucliques, etc.).
Ainsi, une sparation est effectue par solubilisation des lipides dans des solvants organiques
(mthanol, chloroforme) et par sparation physique (billes de verres et centrifugation).

Analyse par TLC (qualitatif)

Un moyen rapide et efficace danalyser les lipides extraits est de les faire luer sur des plaques
de chromatographie. La chromatographie est une technique de sparation utilisant les
proprits physiques des composants, du solvant dlution et de la phase stationnaire (plaque de

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silice). Suivant laffinit du compos pour la phase stationnaire ou lluant, celui-ci est plus ou
moins entrain le long de la plaque. Lorsquil sagit dun mlange, chacun des composs sont
entrain diffremment, permettant ainsi une sparation de ceux-ci. Par la suite, les lipides sont
rvls laide de substances chimiques.

Diffrents solvants sont utiliss en fonction du type de lipide souhaitant tre lu. Par exemple,
les lipides acides seront plus facilement entrain par des solvant contenant un peu dacide et
inversement pour les basiques.

Les produits utiliss pour rvler les lipides sont choisis en fonction des types de lipides
observer. La vapeur diode permet de rvler la plupart des lipides de manire gnrale. Une
solution de mthanol, acide sulfurique et MnCl2 permet didentifier tout les lipides mais colore
diffremment les lipides saturs et les lipides insaturs. Finalement la ninhydrine rvle les
lipides contenant des groupes aminos (par ex les PE ou PS).

Analyse par MS (quantitatif)

La spectromtrie de masse permet didentifier un compos par reconnaissance du rapport entre
sa masse et sa charge. La spectromtrie de masse est utilise en parallle avec la
chromatographie en phase gazeuse ou liquide (GC-MS ou LC-MS).

La GC-MS est utilise pour analyser les molcules non-polaires qui deviennent volatiles sous
leffet de la chaleur. Lchantillon est chauff, vapor, spar par chromatographie en phase
gazeuse et ionis par un flux dlectron qui a pour effet de fragmenter la molcule avant dtre
analys par le spectromtre de masse. Le rsultat de lanalyse est compar une base de donne
afin de dterminer la composition du produit.

La LC-MS permet danalyser des molcules charges (ions). Aprs une sparation par
chromatographie en phase liquide, les flux est envoy dans le spectromtre de masse. Le rsultat
est galement compar une base de donne afin de dterminer la composition du produit.

Dans tout les cas, un standard pour chaque espce de lipide doit tre mesur afin dtalonner le
spectromtre.

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Rsultats :
Figure 1 : 2D-TLC, wild type vs mutant

Lipides neutres Lipides neutres

2eme lution

2eme lution
Phosphatidyl- Phosphatidyl-
ethanolamine ethanolamine

Phosphatidyl- Phosphatidyl-
choline choline
Phosphatidylinositol Phosphatidylinositol

Wild
type
1ere lution Mutant 1ere lution

luant : 1ere dim. Chloroforme/mthanol/ammoniaque 25% (65 :35 :5)

2eme dim. Chloroforme/mthanol/acide actique/eau (89 :9 :12 : 2)

On voit ainsi que la seule diffrence remarquable est la disparition importante de phosphatidyl-
ethanolamine (PE) dans le mutant.

Figure 2 : 1D-TLC pour dtections de strol et lipides par deux solvants

1. Triolein standard

2. Cholestrol 2eme lution

3. Cholesteryl olate standard

4. Lipide extrait du type sauvage
1ere lution

5. Lipide extrait du mutant

6. Ergostrol standard

7. Phospholipide mix standard

1 2 3 4 5 6 7

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Systme deux lutions :

- 1er solvant (lution de 3 [cm] depuis les spots) : Ether de ptrole/Diethyl ther (1:1, v/v)
- 2me solvant (lution de 6 [cm] depuis les spots) : Ether de ptrole/Diethyl ther (49:1,
v/v)

Cette analyse nest malheureusement pas suffisamment indicative, car aucune diffrence nest
notable entre le type mutant et le type sauvage. Des analyses supplmentaires sont donc
ncessaires.

Figure 3 : TLC ninhydrine spcifique aux groupes amines (PE et PS)

luant :

Ether de ptrol/diethyl ther (49 :1)

1. PA standard

2. PE standard

3. Type sauvage

4. Type mutant

5. Mlange PL standard (PE, PS et PC) 1 2 3 4 5

Cette TLC montre bien une disparition de PE dans la souche mutante, comme on a dj pu le voir
prcdemment. Nanmoins, la PE tant synthtise postrieurement la PA, et cette dernire
ntant pas visible dans cette analyse, il est ncessaire de porter l'exprience plus loin afin de
vrifier si la synthse est dfaillante au niveau de la PE ou pralablement, au niveau de la PA.

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Figure 4 : TLC iodine pour dtection des lipides non spcifique

luant :

Ether de ptrol/diethyl ther (49 :1)

1. PA standard

2. PE standard

3. Type sauvage

4. Type mutant

5. Mlange PL standard (PE, PS et PC) 1 2 3 4 5

On constate ici que la PA apparat aussi bien chez le type mutant que chez le type sauvage. Le
problme rside donc au niveau de la PE, toujours moins prsente chez le mutant.

Figure 5 : Histogramme des quantit de lipides wild type vs mutant (cf : Annexe)

1.8E+09

1.6E+09

1.4E+09

1.2E+09 PE 34:2

1.0E+09 PE 32:2 WT
Mutant
8.0E+08

6.0E+08

4.0E+08

2.0E+08

0.0E+00
PC PE PI PS

En faisant une comparaison quantitative entre le mutant et le type sauvage, on constate que
seule la PE change significativement de concentration, corroborant avec les analyses faites
prcdemment.

On trouve ainsi des facteurs damoindrissements de 7 pour la PE 32:2 et de 5 pour la PE 34:2.

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Discussion & conclusion

1re TLC : chromatographie sur deux dimensions

Cette premire sparation non spcifique a permis de dterminer la compositions lipidique des
deux cultures type sauvage et mutant en sparant les diffrents types de lipides par affinit
lectronique dans un solvant donn . En comparant les deux plaques TLC , on constate que la
phosphatidylethanolamine (PE) prsent dans le type sauvage ne lest plus dans le mutant. Ce
premier rsultat informe donc sur la dfaillance mtabolique du mutant : la voie de synthse
aboutissant de la PE la PS est bloque.

2nd TLC : Strols et lipides neutres

La deuxime chromatographie base sur la comparaison de lipides standard au type sauvage et
au mutant ne donne aucun rsultat significatif et utilisable pour les cultures cibles : en effet, les
lipides type sauvage et mutant tant des groupes phosphatidyl, ceux-ci ne prsentent aucune
similitude avec les autres strols et lipides neutres standards utiliss ici. Ce rsultats tait donc
attendu.

3me TLC : glycrophospholipides

Cette troisime chromatographie base sur le mme principe que pour les strols et lipides
neutres (comparaison de standards au lipides cibles) permet de dterminer spcifiquement le
type de glycrophospholipe obtenu. En effet, les standards utiliss pour cette analyse tant tous
des drivs de ce phospholipide (PE, PA et PL mix), la comparaison est donc uniquement base
sur la comparaison des diverses migrations.

La rvlation de la plaque TLC la ninhydrine montre que le type sauvage et le mutant ne sont
pas de simples glycrophospholipides sans groupes fonctionnels (no head group) comme la PA,
puisque non rvl par marquage spcifique aux groupes amines : le type sauvage prsente le
mme type de migration que la PE standard, tandis que le mutant prsente une petite migration
(migration tout de mme suffisante pour liminer lhypothse de la PA). On en conclut donc que
le type sauvage est une phosphatidythanolamine.

Le marquage par une solution de iodine rvlant non seulement la prsence de PE pour le type
sauvage ( linverse du mutant) permet de rvler une faible quantit de migrant pour le mutant
dans les zone spcifiques de la PE. Ceci implique que le mutant prsente quasiment les mmes
caractristiques que le type sauvage ou plutt que le mutant est soumis une contrainte
mtabolique. La voie mtabolique est donc bloque, si lon saccorde au schma suivant (figure
6), au niveau de la phosphatidylsrine. Notre mutant est donc une PS.

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Figure 6 : Voie biosynthtique des phosphoglycrides[1]

Cependant, comme dj mentionn, il existe tout de mme une certaine concentration de PE

pour le mutant (spot claircit). Ceci permet daffirmer quil existe une autre voie de biosynthse
entre la PS et la PE. Cette voie est appele the Kennedy pathway .

Source : http://www.chups.jussieu.fr/polys/biochimie/LLbioch/POLY.Chp.6.10.html

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La voie utilise pour la formation de PE est donc celle du passage
Phosphatidates -> Diglycride -> Phosphatidylthanolamine.

Le principe de ce mcanisme est lutilisation dune coenzyme cytidine diphosphate thanolamine

active (dont le prcurseur est la phosphorylthanolamine).

Lanalyse quantitative des rsultats obtenus prcdemment faite par spectromtrie de masse
permet daffirmer la nature des lipides du type sauvage et du mutant : les intgrales calcule
pour la quantit de PE dans les deux souches sont significativement diffrentes.

Type sauvage Type sauvage Type sauvage

Standard PE 24:0 PE 32:2 PE 34:2
9.03E+07 2.61E+08 4.95E+08

Mutant Standard PE Mutant PE Mutant PE
24:0 32:2 34:2
8.65E+07 3.55E+07 8.19E+07
Ratio 1 7 5

On constate donc que la quantit de PE est de 6 7 fois plus grande pour le type sauvage alors
quil ne change pas pour les standards. On en conclut donc que le type sauvage est de la
phosphatidylethanolamine et le mutant une phosphatidysrine ayant suivit une seconde voie de
synthse, savoir The Kennedy pathway, afin de mtaboliser la PE. Pour valider cette
conclusion, il suffit de comparer pour un autre type de lipide, par exemple , la
phospatidylinositol :

Type sauvage Type sauvage Type sauvage

Standard PI 16:0 PI 32:1 PI 34:1
2.37E+07 2.95E+06 2.38E+06

Mutant Standard PI Mutant PI Mutant PI
16:0 32:1 34:1
2.13E+07 6.87E+06 8.85E+06
Ratio 1 0 0

Pour la PI il ny a donc aucune diffrence significative entre quantit de type sauvage et mutant,
ne montrant donc aucune mutation dans ce cas.

Sources

- [1] Protocole de Travaux pratique de biochimie pour chimistes et biochimistes 2eme anne

- [2] The journal of biological chemistry : http://www.jbc.org/content/280/25/e22.full

- [3] http://www.chups.jussieu.fr/polys/biochimie/LLbioch/POLY.Chp.6.10.html

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Annexes
Graphiques chromatogram de PE du wild type et du mutant :

Nous attestons que dans ce texte toute affirmation qui nest pas le fruit de ma reflexion
personnelle est attribue sa source et que tout passage recopi dune autre source est en outr
place entre guillemets.

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