Agents Infectieux, EDR

Agents infectieux:
métabolisme
Pr Angélique NDJOYI MBIGUINO
Département Bactériologie-virologie
Institut Supérieur de Biologie Médicale
Université des Sciences de la Santé
I- Objectifs
Connaître l’ensemble des réactions

biochimiques de dégradation et de
biosynthèse des substrats nécessaires à leur
croissance des bactéries.
La connaissance de ces différents points est
un élément essentiel à la compréhension des
tests effectués et des réactions observées en
laboratoire de bactériologie.
II- Métabolisme bactérien (1)
1I. 1- Introduction
Avant de parler de métabolisme bactérien il
est nécessaire de connaître quelques notions
de nutrition chez les bactéries.
II.2- Définition du métabolisme d’un
organisme
Le métabolisme d’un organisme est la somme totale
des réactions chimiques qui se produisent au niveau
de cet organisme.
Il comprend:
-les réactions de dégradation de substrat
(catabolisme)
-les réactions de biosynthèse de substrats
(anabolisme). Ces deux types de réactions nécessitent
l’intervention de catalyseurs qui sont les enzymes.
II.3- Le métabolisme énergétique
En phase de croissance
exponentielle, la synthèse de tous les
constituants bactériens se réalise à partir
des nutriments présents dans le milieu. La
transformation et l’assemblage de ces
constituants nécessite de l’énergie.
1I.3.1- Les substances énergétiques

Elles fournissent aux bactéries les moyens d’avoir
une source d’énergie nécessaire à la biosynthèse.
Ainsi, les bactéries doivent trouver dans leur milieu
environnant:
- de l’eau;
- une source d’énergie;
- des composés susceptibles de fournir des
éléments constitutifs de la bactérie;
- des facteurs de croissance.
II.4 - Sources d’énergie
C’’est le métabolisme énergétique qui fournit l’énergie.
II.4.1 Nécessité d’une source d’énergie

Toute cellule consomme de l’énergie pour réaliser :
-les biosynthèses endothermiques des constituants
bactériens;
- les diverses activités (mouvements, transports actifs etc.).
la molécule de transfert d’énergie est l’ATP
(Adénosine-Tri-Phosphate), via son hydrolyse.
Cette hydrolyse se fait par coupure d’une liaison
avec l’intervention de l’eau et d’une ATPase.
ATP + eau ADP + Pi + Energie
L’ATP présente dans la cellule est en faible
quantité et doit être reconstituée.
Les mécanismes énergétiques permettant de
reconstituer de l’ATP sont :
- la photophosphorylation;
- la phosphorylation oxydative;
- la phosphorylation au niveau du substrat.
L’ATP joue un rôle de liaison

entre les sites de synthèse et les sites de son
utilisation.
L’assimilation de phosphore se
fait sous forme d’HPO42- et d’H2PO4-
II.1- L’ATP au centre du métabolisme
11.1.I Structure
L’ATP est constituée de trois molécules de
phosphates, d’un ribose et d’une adénine.
(diapos)
I1.2.2 Synthèse et hydrolyse
11.2.2. 1 Synthèse
Elle s’effectue à l’aide de l’ATP
synthétase
ADP +Pi + énergie ATP + H2O
11.2.2.2 Hydrolyse
L’ATP est constamment hydrolysée. Cette
opération s’effectue grâce à l’ATPase
ATP+H20 ADP+ PI + énergie
11.2.2.3 Importance dans le métabolisme

cellulaire
Les molécules d’ATP jouent un rôle de
« navette » énergétique entre les lieux de
synthèse et les lieux d’utilisation de l’ATP.
1I.2- Métabolisme énergétique
Les bactéries chimiohétérotropes, bactéries
pathogènes, produisent leur énergie suite au
métabolisme d’un substrat.
Cette énergie, produite sous forme d’ATP se
fait par 2 voies:
- la fermentation, dans laquelle les
composants organiques servent aussi bien de
donneurs que d’accepteurs d’è;
- la respiration, dans laquelle l’O2
ou d’autres composés oxygénés
inorganiques agissent comme accepteurs
terminal d’è.
1I.2.1 Fermentation
Se définit comme un ensemble de
réactions biochimiques anaérobies
d’oxydation et de réduction procurant à la
bactérie, l’énergie nécessaire à ses
biosynthèses.
Le glucose est le substrat le plus
utilisé.
Sa dégradation conduit à la formation
de produits servant de base à la biosynthèse.
La dégradation du glucose conduit à:
- la formation des acides
organiques;
- la production de gaz;
- formation de métabolites de
dégradation.
1I.2.1.1 Formation d’acides organiques
La fermentation bactérienne des
glucides s’accompagne de la synthèse
d’acides organiques ( acidification du
milieu qui fait virer l’indicateur coloré).
Trois sortes de milieux sont utilisés:
- le milieu glucidique liquide simple, exemple du
milieu nutritif liquide à sucre
- le milieu glucidique gélosé simple, exemple du
milieu mannitol mobilité, contenant du mannitol, rouge
de phénol et nitrate. Il se présente en culot. Il est
ensemencé par piqûre centrale unique. Permet
d’apprécier en plus de l’utilisation du mannitol (virage
du milieu au jaune de l’indicateur coloré), la mobilité
( culture ou trouble dans toute la masse) du germe. Les
nitrates sont ajoutés pour éliminer les gaz formés qui
pourraient fausser la recherche de la mobilité.
- les milieux glucidiques gélosés
complexes, ex. KIA: Kligler iron agar :
glucose-lactose; TSI: Triple sugar iron:
glucose –lactose-saccharose. Ces milieux se
présentent en gélose inclinée contenant: du
glucose, du lactose/saccharose, du rouge de
phénol, du sulfate ferreux, du thiosulfate de
Na, des peptones. Les milieux sont rouges
au départ et sont ensemencés sur la pente
puis par piqûre centrale au niveau du culot.
Dans un premier temps la fermentation
du glucose conduit à une acidification du
milieu qui fait virer le culot au jaune.
Dans un 2ème temps, la bactérie dégrade
les peptones et le 2 autres sucres.
La dégradation des peptones en Acides
aminés entraîne l’alcalinisation du milieu.
La dégradation des sucres entraîne
l’acidification du milieu.
1I.2.2.2 Production de gaz
La fermentation s’accompagne de la production
d’H2, CO2 ou les 2 à la fois.
H2 lors des réactions d’oxydation des substrats
C02 lors de la dégradation des sucres.
Ces gaz se recherchent sur :
- milieux liquides dans lesquels est immergé un
petit tube renversé appeler « Cloche de Durham », qui
emprisonne le gaz formé sous forme de bulles d’air;
- milieux solides KIA ou la production de gaz
est visible par le décollement de la gélose, formant
une poche d’air.
1I.2.2.3 Formation de métabolites
de dégradation
Au cours de la fermentation du glucose, il y a
formation:
- de divers produits terminaux acides: acide formique,
acide acétique, acide butyrique, acide proprionique…;
- ou d’alcools: méthanol, butanol.
Ces produits sont recherchés sur milieux Clarck et
Lubs.
Deux propriétés fermentaires vont être
recherchées:
- la première est la mise en
évidence de la présence des acides
organiques: c’est la réaction du Rouge de
méthyle( R.M);
- la deuxième est la recherche
d’une étape intermédiaire de la
transformation de l’acide pyruvique qui
consiste en la production d’acétone: c’est
la réaction de Voges-Prauskauer (VP).
Test R.M
Consiste à ajouter au milieu Clarck et
Lubs inoculé depuis 24 h, 2 à 3 gouttes de
solution alcoolique de rouge de méthyl à 0,2%:-
coloration jaune = R.M –
- coloration rouge = R.M +
Test VP
Dans un tube contenant le milieu Clarck
et Lubs inoculé depuis 24 h, ajouter:
O,5 ml de solution α-naphtol et 0,5ml de KOH
à 16%, agiter le tube en position inclinée
pendant 10 minutes, si:
- aucune coloration = réaction VP-
- coloration rose = réaction VP +
Les bactéries sont normalement RM -, sauf
Listeria monocytogenes.
1I.2. Respiration
La fermentation est processus de production
d’énergie relativement inefficace, car le glucose
n’est jamais complètement oxydé.
Dans la respiration un substrat pluri carboné
est successivement oxydé jusqu' ’au stade mono
carboné CO2 et H2 , donc l’énergie produite ici est
plus importante que celle produite durant la
fermentation.
Les enzymes de la respiration sont: les
oxydases, les catalases, les nitrates réductases.
La respiration est caractérisée par l’accepteur final
d’è:
- O2: respiration aérobie;
- substrat d’oxygène inorganique: respiration
anaérobie.
Quelque soit le type respiratoire, la production
d’énergie implique 2 processus différents et
complémentaires:
- la transformation des composés carbonés en CO2;
- le transport des électrons.
1I.2.1 Le cycle tricarboxylique de Krebs
Ce cycle permet l’oxydation complète
des composés carbonés.
Le pyruvate est l’intermédiaire
principal du métabolisme des hexoses
durant la glycolyse.
Dans les conditions d’aérobiose, le
pyruvate est converti en Acétyl CoA qui est
le substrat du cycle de Krebs.
Cycle absent chez les bactéries à
métabolisme fermentaire , comme le
Clostridium.
La présence de ce cycle chez une
bactérie se fait par l’utilisation du citrate
comme seule source de carbone.
Seules les bactéries douées d’un
pouvoir respiratoire peuvent oxyder le citrate
par l’intermédiaire du cycle de Krebs.
Au laboratoire ont dispose de 2 milieux:
- milieu Simmons, qui est un milieu synthétique
contenant du citrate et du bleu de bromothymol. Il se
présente en tube sur gélose inclinée. L’ensemencement
se fait aux 2/3 du tube. Après incubation, la
dégradation se traduit par un virage du milieu du vert
au bleu. Vert Bleu: Métabolisme respiratoire; Vert Vert:
Métabolisme fermentaire ou bactérie ne possédant pas
les perméases nécessaires pour la pénétration du citrate.
- milieu de Christensen, milieu semi
synthétique qui contient en plus du citrate,
du glucose en faible quantité, et un
indicateur de pH, le Rouge de phénol. La
faible quantité de glucose servira à la
synthèse de la perméase qui facilitera la
pénétration de citrate dans la bactérie.
Après ensemencement, colonies roses:
réaction christensen + ; pas de coloration :
réaction christensen - .
1I.2.2 Voies d’attaque des glucides
Les bactéries chimiohétérotrophes produisent leur
énergie à partir d’un substrat organique qu’elle dégrade
selon 2 voies métaboliques: la fermentation et la
respiration.
Au laboratoire, l’épreuve de Hugh- Leifson permet de
déterminer la voie empruntée .
On utilise des géloses molles, comme le milieu
M.E.V.AC , qui est une gélose semi solide contenant du
glucose et du Rouge de phénol.
L’ensemencement , se fait par piqûre centrale.
1I.2.3 Transport d’è
Chez les bactéries, le transport d’è se fait
au niveau de la membrane cellulaire.
Les électrons et les protons libérés par
un composé énergétique AH2, ne sont pas
transmis immédiatement à l’accepteur d’è final,
mais se fait ( à partir d’un composé énergétique
AH2 réduit) par une succession d’étapes
catalysées par des déshydrogénases.
Les composants majeurs d’un chaîne de
transport d’è sont:
- des coenzymes pyrimidiniques;
- des flavoprotéines (FAD,NADH);
- des quinones (ubiquinones,
menaquinones);
- des cytochromes ( Cyt c,
cytochrome oxydase aa3;
Ces cytochromes sont identifiés au
laboratoire par le test de l’oxydase.
Ce test révèle la présence des
cytochromes C et aa3 de la chaîne respiratoire
aérobie.
En pratique la recherche de l ’oxydase se
fait par les test de Kovacs: on prélève une anse
de culture que l’on dépose sur du papier
buvard imprégné de réactif.
Si:
- coloration rouge violacée = oxydase +
- pas de coloration = oxydase -
1I.2.4 Respiration aérobie
Elle correspond à une série de
transfert d’è jusqu’à un accepteur final qui
est l’O2 moléculaire et à une synthèse
concomitante d’ATP.
Au cours de cette respiration, il se
produit des réactions non cytochromiques
qui aboutissent à la formation de H 2O2
toxique pour la bactérie. Cette bactérie
synthétise une enzyme de détoxification: la
catalase.
catalase
H2O2 H2O + ½ O2
L’O2 libéré est mis en évidence par
contact d’une colonie bactérienne avec une
goutte d’H2O2 à 10 vol.
Si:
- formation de bulles d’air =catalase +
- pas de bulles d’air = catalase -
1I.2.5 Respiration anaérobie
La production d’énergie par un métabolisme
oxydatif peut aussi avoir lieu en anaérobiose.
Les voies de dégradation du carbone sont
identiques à la respiration aérobie et le transfert d’è
se fait à l’aide d’une chaîne respiratoire similaire à
celle des aérobies.
L’accepteur d’è final n’est plus l’O 2 mais un
composé inorganique oxygène ex. NO 2 (nitrate),
NO3 (nitrite) se fait grâce à une enzyme la nitrate
réductase.
La présence de cette enzyme est un
caractère de classification recherchée au labo.
La nitrate réductase est mise en
évidence par ensemencement d’un bouillon
nitrate contenant du nitrate de K à 1%.
Après incubation, la lecture se fait après
addition des réactifs de Griess-Howay:
NR1 = Ac sulfanilique: 10 gouttes
NR2 = α-naphtylamine: 10 gouttes
Il s’agit d’une réaction de diazotation.
Si:
- apparition coloration rouge = NR+
- pas de coloration rouge = bactérie
dénitrifiante NO3 N2 ou absence de
NR
Ajouter à la préparation de la poudre
de zinc et après un léger chauffage: Si:
- coloration rouge = NR-
- pas de coloration rouge = NR +
1I.3- Métabolisme glucidique
Il est identique à celui du métabolisme
énergétique.
Les tests déjà cités permettent d’explorer
ces deux métabolismes.
1I.3.1 Recherche de la β-galactosidase

C’est une enzyme qui hydrolyse le lactose
en glucose et galactose.
Elle a 2 caractéristiques:
- elle est intracellulaire, car ne
peut agir sur le lactose que si celui-ci pénètre
à l’intérieur de la cellule bactérienne.
- elle est inductible, c.à.d. , elle est
synthétisée uniquement si la culture
bactérienne est faite en présence de lactose.
En pratique, on recherche la β-
galactosidase à partir des bactéries récoltées
en milieux gélosés lactoses.
Les colonies sont mises en suspension
dans l’H2O distillée stérile avec un disque
d’ONPG [(orthonitrophénol β- galactoside
(β-galactose substitué)].
Après incubation à 37°C:
- coloration jaune = R+ = ONPG+;
- pas de coloration = R - = ONPG -
1I.3.2 Utilisation de l’Esculine
L’esculine est hydrolysée en esculine
glucose.
Pour cela, une substance appelée
l’esculetine se combine avec les sels de fer
donnant une réaction colorée en noir.
Cette réaction peut se faire sur 2 milieux:
- milieu à l’esculine : milieu gélosé
ensemencé par piqûre centrale dont, la réaction
positive est le noircissement du milieu;
- milieu bile-esculine, qui permet de
rechercher 2 caractères:
* hydrolyse de l’esculine,
caractérisée par le noircissement du milieu;
* croissance en milieu hostile
(contenant de la bile).
1I.4- Métabolisme protidique
L’hydrolyse enzymatique des
protéines aboutit à la libération d’acides
aminés dont le catabolisme fait appel à
certains enzymes spécifiques.
1I.4.1 Recherche de la gélatinase
Se fait par la méthode de la pellicule photographique,
qui consiste à réaliser dans un tube à partir d’une culture
jeune, une suspension dense du germe en H 2O distillée
stérile et d’ajouter une goutte de toluène et une languette
de pellicule photographique. Après incubation à 37°C
pendant quelques heures, l’action de la gélatinase se
traduit par la mise à nu de la partie immergée de la
languette de pellicule qui devient transparente.
1I.4.2 Recherche des désulfhydrases
Ces enzymes agissent sur les acides aminés
soufrés, ex. la cystéine…., en produisant du
sulfure d’hydrogène (H2S).
La présence de l’enzyme est mise en évidence au
laboratoire sur milieu T.S.I ( Triple Sugar Iron),
qui contient entre autre du sulfate ferreux.
Le sulfure d’hydrogène en présence
de sels métalliques ( sulfate ferreux) donne
naissance à un sulfure métallique insoluble
le F2S (sulfure de fer), qui se traduit par un
noircissement du milieu
FeSO4H2S FeS (précipité noir)
1I.4.3 Recherche de:
° Lysine décarboxylase (LDC);
° Ornithine décarboxylase (ODC);
° Arginine dihydrolase (ADH).
ADH
Arginine Agmatine
LDC
Lysine Putrescine
ODC
Ornithine Cadavérine
Ces enzymes sont mis en évidence en milieu liquide
Moeller-Falkow.
Ce milieu contient des peptones, du glucose, du pourpre de
bromocrésol, des acides aminés.
L’étude d’une seule souche bactérienne nécessitera 4 tubes:
T - ADH – LDC – ODC.
Les milieux sont ensemencés avec une suspension
bactérienne dense puis seront recouverts d’huile de vaseline stérile
(huile de paraffine). Après incubation:
- le tube T sera obligatoirement jaune;
- si les tubes ADH,LDC, ODC sont jaune = R-
- si les tubes ADH, LDC, ODC, sont violet = R+
( alcalinisation du milieu qui fait virer l’indicateur de pH du jaune
au violet).
1I.4.4 Recherche de la T.D.A
( Uréase-Tryptophanase-Tryptophane
désaminase)
La mise en évidence de ces 3 enzymes se
fait sur un seul et même milieu: Milieu de
Ferguson( milieu urée-indole).
C’est un milieu contenant de l’urée, du
tryptophane et du rouge de phénol.
La présence de ces 3 enzymes est mise en
évidence par la détection des métabolites.
Uréase:
uréase
Urée CO2 NH3(alcalinisation)
Si :
- virage du milieu au rouge violacé = R+
= Uréase +;
- pas de virage = R- = Uréase -
Tryptophanase:
Tase
Tryptophane Indole
L’indole est extrait en phase alcoolique par addition

du réactif de Kovacs (dimethyl para amino benzaldehyde,
dans l’alcool amylique).
Après agitation:
- anneau rouge =R + = Tryptophanase +
-anneau jaune = R- = Tryptophanase –
Cette enzyme peut aussi être recherchée sur milieu
peptoné exempt d’indole.
Tryptophane des aminoses TUA:
TDA
Tryptophane Acide indole pyrique

Ce métabolite réagit avec les
perchlorures de fer (réactif TUA), en
donnant un précipité noir = TUA +
1I.5- Métabolisme lipidique
1I.5.1 Recherche des lipases
Les lipases sont des enzymes qui hydrolysent les
esters d’acides gras à longue chaîne carbonée, ex. le
Tween, qui est un ester de sorbitol et d’acide gras.
La recherche de lipase se fait par la technique de
SEIRRA, qui consiste à incorporer dans une gélose
ordinaire 1% de Tween 80 CaCl2, on coule en boîte de
Pétri et on ensemence les souches.
Après incubation: R + = formation d’un halo
opaque autour des colonies, lié à la précipitation des
acides gras sous forme de sels de calcium.
1I.5.2 Recherche de lécithinase
Cette enzyme hydrolyse la lécithine.
Elle est détectée par une technique qui
consiste à enrichir une gélose ordinaire par
l’incorporation d’un jaune d’œuf.
Ensemencer par touches.
Après incubation: R + =opacification
autour des colonies.
MERCI DE VOTRE ATTENTION

Agents Infectieux, EDR

Transféré par

Informations du document

Titre original

Copyright

Formats disponibles

Partager ce document

Partager ou intégrer le document

Options de partage

Avez-vous trouvé ce document utile ?

Ce contenu est-il inapproprié ?

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Agents Infectieux, EDR

Transféré par

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Agents infectieux:

Pr Angélique NDJOYI MBIGUINO

Connaître l’ensemble des réactions

1I.3.1- Les substances énergétiques

II.4.1 Nécessité d’une source d’énergie

L’ATP joue un rôle de liaison

11.2.2.3 Importance dans le métabolisme

1I.3.1 Recherche de la β-galactosidase

L’indole est extrait en phase alcoolique par addition

Tryptophane Acide indole pyrique

Vous aimerez peut-être aussi